Estudio de los efectos de mutaciones naturales y modificaciones postraduccionales sobre la estabilidad y funcionalidad de la enzima asociada a cáncer NQO1

Resumen

La estabilidad y función de las proteínas puede verse afectada por el efecto de mutaciones que provocan la sustitución de un aminoácido por otro (mutación de cambio de sentido) así como por modificaciones postraduccionales. Cuando ese efecto es heredable y se pierde la estabilidad y función de la proteína, a menudo se desarrollan enfermedades conocidas como enfermedades de pérdida de función. Por ejemplo, las flavoproteínas, que tienen múltiples funciones, están asociadas a distintas enfermedades hereditarias debido a mutaciones que provocan la pérdida de su función. Concretamente, en esta tesis vamos a estudiar el efecto de mutaciones naturales y modificaciones postraduccionales en la proteína NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), una flavoproteína multifuncional cuya pérdida de función por el polimorfismo P187S se ha asociado con un posible incremento del riesgo de padecer cáncer. En primer lugar, hemos estudiado distintas variantes naturales que han sido detectadas en estudios de secuenciación masiva en la población y en muestras de cáncer, pero cuyo efecto sobre la estabilidad y función de NQO1 se desconocía. Estas variantes presentaban mutaciones de cambio de sentido en el extremo N-terminal y en el sitio activo de la proteína, y el efecto de esas mutaciones se propagó a regiones alejadas del sitio mutado, provocando en algunos casos una menor estabilidad térmica, una reducción en la afinidad por FAD y una menor actividad catalítica. En segundo lugar, comparamos como se asemeja la desestabilización causada por una fosforilación a la causada por el polimorfismo asociado a enfermedad P187S, utilizando la mutación fosfomimética S82D. Para ello, estudiamos como ambas mutaciones afectaban a la estabilidad estructural de la proteína en distintas regiones mediante intercambio de hidrógeno-deuterio acoplado a espectrometría de masas (HDX-MS) combinándolo con estudios de proteólisis limitada, ensayos enzimáticos y experimentos en cultivos celulares. Los resultados mostraron que tanto S82D como P187S tienen varios efectos sobre NQO1, como la reducción de la actividad catalítica o la estabilidad intracelular, que se produce por la propagación estructural de su efecto desestabilizante a varios sitios funcionales. En tercer y último lugar, comparamos las consecuencias de la fosforilación específica de sitio en tres residuos (S40, S82 y T128) que presentan distinta exposición al solvente 6 siguiendo la metodología utilizada con S82. En este caso, vimos que cada mutación fosfomimética (S40D, S82D y T128D) tuvo un efecto diferente. S82D causó la mayor desestabilización afectando fuertemente a la afinidad por FAD y su actividad enzimática y a la estabilidad conformacional e intracelular. Mientras que S40D afectó principalmente a la estabilidad conformacional e intracelular y T128D no tuvo un efecto apreciable sobre la estabilidad de NQO1, pero sí sobre la actividad enzimática.