Evaluación de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) como mecanismo preventivo de la infección por VIH en el aparato genital femenino

Resumen

Las mujeres representan la mitad de la población infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en el mundo. A pesar de que el número de nuevos diagnósticos en mujeres en edad reproductiva está descendiendo, las tasas de contagio están incrementando en mujeres mayores de 50 años. La principal vía de adquisición del VIH en mujeres es por transmisión sexual; sin embargo, la tasa de contagio por contacto sexual es baja, indicando la presencia de mecanismos de inmunidad innata que protegen el tracto genital femenino (TGF) de infecciones. Entre las células del sistema inmunológico innato que residen en la mucosa genital, los neutrófilos son los leucocitos más abundantes. Los neutrófilos se caracterizan por presentar un amplio abanico de respuestas frente a patógenos, entre las que encontramos: degranulación, liberación de especies reactivas del oxígeno (ROS, reactive oxygen species), fagocitosis o la liberación de Trampas Extracelulares de Neutrófilos (NETs, neutrophil extracellular traps). Las NETs son estructuras en forma de red compuestas por fibras de ADN y recubiertas por proteínas con actividad antimicrobiana. Los neutrófilos liberan estas NETs con el fin de atrapar e inactivar patógenos. Nuestro grupo de investigación demostró en publicaciones anteriores que los neutrófilos genitales de mujeres en edad reproductiva (premenopáusicas) liberan NETs de manera inmediata en respuesta al VIH. Además, estas NETs se caracterizan por tener la capacidad de inactivar al virus de manera irreversible, lo que representa un mecanismo protector innato de la mucosa genital frente a la infección por VIH. Sin embargo, aún se desconocen los eventos moleculares subyacentes involucrados en el reconocimiento viral y la liberación de NETs, así como hasta qué punto la protección innata de la mucosa cambia en el tracto genital femenino con el envejecimiento. Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron muestras humanas del tracto genital femenino (24-77 años) y de sangre (18-72 años) procedentes de mujeres donantes sanas. Estas muestras fueron procesadas para la obtención de suspensiones celulares y purificación de neutrófilos. Las células se estimularon in vitro con partículas virales de VIH (PV-VIH) para inducir y evaluar la liberación de NETs. Los resultados obtenidos demostraron que la formación de NETs en respuesta a VIH está impedida en neutrófilos genitales y de sangre procedentes de mujeres postmenopáusicas, reduciéndose de forma progresiva a medida que éstas envejecen. Los neutrófilos genitales y sanguíneos liberaron NETs tras reconocer el material genético del VIH a través de dos receptores tipo Toll (TLRs, Toll-like receptors) endosomales: TLR7 y TLR8. TLR8 está involucrado en la liberación temprana de NETs (0-15 min) y TLR7 en la liberación tardía (15 min-2 h). No obstante, también se identificaron diferencias en los mecanismos de liberación de NETs entre los neutrófilos de sangre y del TGF. En los neutrófilos sanguíneos, la envoltura del VIH es también reconocida, induciendo la liberación de NETs y un rápido incremento en los niveles de calcio intracelular. Esta respuesta de calcio se redujo significativamente en mujeres a medida que aumentaban en edad, suponiendo también una disminución en la liberación de NETs. Por el contrario, los neutrófilos genitales no mostraron un aumento en los niveles intracelulares de calcio cuando se estimularon con VIH. Los neutrófilos genitales únicamente liberaron NETs tras reconocer el VIH a través de los TLRs endosomales, y la ruta de señalización mediada por TLR8 se vio negativamente afectada en mujeres postmenopáusicas, suponiendo una reducción en la liberación de NETs. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción de diferentes respuestas por parte de neutrófilos de sangre y de tejido ante el mismo patógeno. Además, es la primera demostración de que el envejecimiento a partir de la menopausia afecta la liberación de NETs en respuesta al VIH, lo que proporciona información importante para comprender la susceptibilidad a la infección a medida que las mujeres envejecen. Nuestros hallazgos resaltan que las respuestas de los neutrófilos tisulares no pueden predecirse simplemente a partir de modelos de neutrófilos sanguíneos. El proceso de liberación de NETs puede implicar la ruptura de la membrana celular del neutrófilo o no comprometer su integridad. Se diferencia entonces entre liberación lítica de NETs, un proceso asociado con inflamación y muerte celular; y liberación no lítica de NETs, que no compromete la viabilidad. En este estudio identificamos por primera vez dos marcadores (anexina V, ANXV; y lactoferrina, LTF) que permitían la tinción específica de NETs producidos a través de vías líticas, lo cual posibilita la diferenciación entre NETs líticos y no líticos. Considerando la incorporación o no de estos marcadores en los NETs, identificamos que los neutrófilos sanguíneos liberaban NETs en respuesta al VIH a través de vías líticas y no líticas. Sin embargo, los neutrófilos genitales realizaban preferencialmente la liberación no lítica de NETs en respuesta al virus. Estos resultados indican que la liberación de NETs en los tejidos genitales no está a asociada a inflamación. La inflamación está relacionada con un aumento del daño tisular y un mayor reclutamiento de células inmunológicas. En el contexto de infección por VIH, estas consecuencias potenciarían el contacto entre el VIH y sus células diana. Por tanto, nuestros resultados sugieren que la liberación de NETs en la mucosa genital desempeña funciones protectoras frente a la adquisición del VIH, suponiendo un mecanismo de la inmunidad innata involucrado en la prevención del contagio por VIH. En resumen, nuestros resultados indican que la liberación temprana de NETs en respuesta al VIH se reduce progresivamente en las mujeres a partir de la menopausia. Esta reducción se debe a la alteración de mecanismos involucrados en el reconocimiento del VIH, viéndose afectadas diferentes rutas dependiendo de si los neutrófilos son sanguíneos o residentes en la mucosa genital. Además, identificamos que la estimulación con VIH inducía la liberación de un conjunto de NETs que incorporaban anexina V. Estos NETs se visualizaron predominantemente en neutrófilos sanguíneos, sugiriendo propiedades proinflamatorias que estarían ausentes en los neutrófilos de la mucosa genital. Con ello, concluimos que las respuestas de neutrófilos tisulares no pueden ser simplemente extrapoladas a partir de modelos de neutrófilos sanguíneos, que la liberación de NETs por parte de neutrófilos genitales supone un bajo daño tisular y un mínimo reclutamiento de células diana para el VIH en el tracto genital femenino, y que la reducción de NETs en respuesta al VIH en mujeres postmenopáusicas a medida que avanzan en edad podría representar un factor de mayor riesgo de infección por VIH.