Nuevos colorantes fluorescentes para la detección de agregados amiloides y el estudio de su efecto citotóxico

Resumen

Esta tesis doctoral se ha realizado en el Departamento de Fisicoquímica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada, en el marco de los proyectos “Synthesis and applications of homochiral photoactive organic systems” (CTQ2017-85454-C2-1-P) y “TG-DiAG: Nuevas estrategias de diagnóstico basadas en fluorescencia con ventana temporal” (CTQ2017-85658-R), y se planteó con el objetivo general de estudiar los procesos de agregación amiloide implicados en el desarrollo de las enfermedades neurodegenerativas y su citotoxicidad, mediante el uso de nuevos colorantes fluorescentes y técnicas avanzadas de espectroscopía y microscopía de fluorescencia. Para la lograr este objetivo se han realizado varios estudios centrados tanto en los procesos de amiloidogénesis de la proteína apoferritina (APO) como del péptido β- amiloide (Aβ). Así, se ha realizado un cribado de fluoróforos derivados de quinolimida que pueden actuar como posibles indicadores de la agregación proteica de la APO, comprobándose que el compuesto 9-azetidinil-quinolimida (AQui) era el mejor candidato entre todos los estudiados como sensor de agregación. Para incrementar la sensibilidad de la detección del proceso de agregación de la APO se seleccionó un par adecuado de fluoróforos consistente en el fluoróforo dador AQui y el fluoróforo aceptor Nile Blue A (NBA) que, mediante la microscopía FLIM multiparamétrica y el análisis de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) originada entre ellos, permitieron investigar dicho proceso de agregación eficazmente. Paralelamente, se ha estudiado la interacción y el efecto citotóxico de agregados de Aβ con la membrana celular mediante microscopía PIE-FLIM, demostrándose que existen dos tipos de poblaciones de agregados con diferente toxicidad celular. Asimismo, se ha evaluado el estrés celular generado por los agregados de Aβ en células neuronales con una sonda de biotioles (GG-DNBS) mediante microscopía FLIM multiparamétrica, concluyéndose que los agregados formados a 0.5 h de incubación eran los que más niveles de biotioles generan y, por tanto, los que provocan un mayor estrés en las células neuronales. Por otra parte, se han caracterizado dos nuevos colorantes luminiscentes derivados de la quinolin-2(1H)-ona portadores de grupos carboxilato o fosfonato (CAnt y PAnt), y se han evaluado como antenas de lantánidos biocompatibles capaces de autoensamblarse directamente en disolución acuosa in vitro e in cellulo. Mientras CAnt se coordina con el catión Tb3+, PAnt es capaz de coordinarse con los cationes Eu3+ y Tb3+. Mediante el empleo de los complejos formados por PAnt y los lantánidos Eu3+ y Tb3+ se ha conseguido obtener la emisión de luz blanca en disoluciones acuosas y en geles de agarosa. Además, se han utilizado como sondas intracelulares para bioimagen mediante microscopía PLIM, así como para la obtención de luz blanca in cellulo.