Optimización del análisis de ADN de restos óseos críticos

Resumen

El descubrimiento en 1986 de las aplicaciones forenses del análisis de ADN con fines de identificación supuso una revolución en el campo de las Ciencias forenses, consolidándose como una de las disciplinas más aceptadas por los tribunales de todo el mundo. Sin embargo, y pese a la multitud de avances que han enriquecido la disciplina como la PCR en un primer momento o la secuenciación masiva más recientemente, la Genética forense no ha estado exenta de problemas, como son los perfiles mezcla, las muestras mínimas, o la degradación del ADN. En contextos como el crimen organizado, el terrorismo, las grandes catástrofes, o las fosas comunes, el análisis de ADN en restos humanos suele constituir la única vía posible para la identificación, habida cuenta que huesos y dientes son las únicas muestras biológicas que permanecen con el paso del tiempo. Este tipo de muestras son especialmente desafiantes para los laboratorios de Genética forense, puesto que, además de tener poca cantidad de ADN, este suele encontrarse degradado. A este hecho se une la dificultad, en algunos contextos en los que el suceso y las actuaciones de identificación están muy separadas en el tiempo, de la relación familiar distante entre las muestras de restos humanos y los familiares de referencia con los que se harán las eventuales comparativas. La optimización y puesta a punto de los protocolos de análisis de restos humanos degradados para un máximo rendimiento en la obtención de un perfil genético resulta, por tanto, de especial interés para la disciplina. El Laboratorio de Identificación Genética de la Universidad de Granada, primero con el programa Fénix y más recientemente con el convenio con la Junta de Andalucía de identificación de las víctimas de la Guerra Civil y la Posguerra española, cuenta con una amplia experiencia en el análisis de restos humanos críticos. Es por ello por lo que se constituyó como el crisol para la realización de esta tesis doctoral, aportando tanto su experiencia previa y presente como la disponibilidad de muestras para los diferentes análisis realizados. El objetivo de la presente tesis doctoral es la optimización del análisis de ADN, en el contexto forense, de restos humanos críticos (huesos y dientes). Para ello se ha realizado una revisión de las diferentes etapas del análisis de ADN: la muestra de restos óseos/dientes, extracción, cuantificación, amplificación, secuenciación, visualización de resultados e informe, revisando también las pautas para asegurar la calidad del proceso en el marco de la norma ISO 17025. Para cada etapa analítica se ha tratado de hacer una comparación de las diferentes técnicas analíticas disponibles, buscando la que mejor rendimiento mostraba para cada una de ellas: En el Capítulo 1, sobre la muestra de restos óseos o dientes, se comparó el rendimiento del análisis de ADN en diferentes restos humanos del mismo individuo: fémur, tibia, dientes, y hueso petroso. Se observó que tanto los dientes como el hueso petroso, especialmente este último, son, en general, los mejores sustratos para obtener un perfil genético. En el Capítulo 2, sobre la extracción de ADN se compararon cinco protocolos de extracción distintos: extracción orgánica, sílice en suspensión, sílice en columna, y con los kits comerciales PrepFiler™ BTA e InnoXtract™. Se vio que el protocolo de extracción orgánica con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico era el que mejor rendimiento tenía en términos de cuantificación y de perfil genético obtenido. En el Capítulo 3, sobre la cuantificación de ADN, se comparó la eficiencia de cuatro kits comerciales de qPCR: Quantifiler™ Trio, PowerQuant™, Quantiplex® Pro, e InnoQuant™ HY. Este último kit destacó en términos de sensibilidad a la hora de detectar ADN, así como en la correlación entre la cantidad de ADN observada en la qPCR y el perfil genético que se obtiene posteriormente. En el Capítulo 4, sobre la amplificación de ADN, se compararon kits de STRs autosómicos (Globalfiler™, PowerPlex® Fusion 6C, e Investigator® 24Plex QS), STRs del cromosoma Y (Yfiler™ Plus, PowerPlex® Y23, e Investigator® Argus Y-28), explorándose también la aplicación de un kit de INNULs (InnoTyper® 21) comparando su poder de discriminación con el de un kit de STRs autosómicos (Globalfiler™). Si bien no se observaron diferencias significativas entre los kits de STRs autosómicos, sí se vieron diferencias en términos de mayor número de marcadores obtenidos del kit PowerPlex® Y23 con respecto a los otros. El kit de INNULs obtuvo un mayor número de marcadores que el kit de STRs autosómicos, teniendo, no obstante, un menor poder de discriminación. En el Capítulo 5 se revisan las técnicas de visualización de los resultados, así como el análisis de los perfiles genéticos de restos humanos críticos, y los cálculos estadísticos en los resultados de identificación. En el Capítulo 6, sobre la secuenciación de ADN, se exploró la aplicación de las técnicas de análisis de ADN antiguo en muestras forenses, realizándose en muestras analizadas con STRs autosómicos las técnicas de preparación de librería, shotgun sequencing, enriquecimiento con captura de ADN con el kit comercial Twist Bioscience, y deep shotgun. Finalmente, en el Capítulo 7, se revisan los diferentes puntos contenidos en la norma ISO 17025, sobre los requisitos de competencia de los laboratorios de ensayo, haciendo especial incidencia en los aspectos a tener en cuenta en un laboratorio de Genética forense.