Estudio de la función de SLAMF8 en macrófagos

Resumen

En primer lugar, se realizó un estudio sobre la activación de NOX2 a través de vías directas e indirectas de PKC en Mϕ de ratones deficientes para SLAMF8 (SLAMF8-/-) en comparación con Mϕ de la cepa salvaje (WT, wild type o SLAMF8+/+). Para este estudio las células fueron estimuladas con PMA y LPS puro, y empleamos inhibidores específicos para las vías de activación mediadas por PKC, p38 MAPK y PI3K. Los resultados confirmaron que en ausencia de SLAMF8 la activación de NOX2 a través de PCK estaba incrementada en las subunidades p47phox y p40phox, detectando también una mayor activación de p38 y ERK1/2 MAPK. El estudio con inhibidores confirmó estos resultados, y además no solo mostró la modulación negativa de NOX2 por SLAMF8 a través de estas vías, sino que la inhibición específica de PI3K igualaba la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, Reactive Oxygen Species) entre las muestras. Es más, con el inhibidor de la PI3K las diferencias observadas en las vías de activación de NOX2 desaparecían, igualando el nivel de activación entre Mϕ SLAMF8-/- y WT. Además, el análisis sobre la movilización de las subunidades citosólicas de NOX2 y la reorganización del citoesqueleto de actina, nos mostró que SLAMF8 también regula negativamente estos procesos probablemente a través de su acción sobre la PI3K. Debido a que los resultados indicaron que SLAMF8 actuaba regulando negativamente procesos implicados en la eliminación de microorganismos, se analizó el efecto que podría tener este receptor en la progresión de infecciones graves. Para esto, empleamos un modelo infeccioso por Salmonella typhimurium in vitro. Los resultados mostraron que SLAMF8 era capaz de regular negativamente los mecanismos microbicidas NOX2 e iNOS y sus vías de activación en Mϕ, confirmando de nuevo por el empleo de inhibidores que, la ausencia de SLAMF8 afecta a la vía de activación sobre estos mecanismos por la PI3K. En este estudio además observamos que SLAMF8 afectaba al proceso de modulación que ejerce S. typhimurium sobre la activación de NOX2 e iNOS en el SCV (Salmonella-containing vacuole), analizando la activación de las enzimas a diferentes tiempos de maduración del SCV: temprano, intermedio y tardío. Con objeto de confirmar la modificación en la composición del SCV en sus diferentes estadios de maduración, analizamos el reclutamiento de Rab5, Rab7 y p47phox hacia el SCV mediante microscopia láser confocal. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluyó que la ausencia de SLAMF8 generaba una mayor fusión de fagosomas con lisosomas y una progresión alterada del SCV, lo que probablemente generaba un detrimento de S. typhimurium en el control de la progresión del SCV, fundamental para el mantenimiento y proliferación de la bacteria. Todo esto nos lleva a concluir que SLAMF8 es capaz de modular negativamente la activación de mecanismos microbicidas a través de su acción sobre la PI3K. Creemos que la intervención modula negativamente el bucle de retroalimentación de la PKC y PI3K, ya que la inhibición de PI3K elimina completamente las diferencias observadas entre los Mϕ SLAMF8-/- y WT, estimulados tanto con bacteria como con agonistas de la PKC o LPS puro. Esto concuerda con el hecho de que los Mϕ SLAMF8-/- presenten una mayor polarización y migración, mecanismo que está controlado también mediante el bucle de retroalimentación PKC-PI3K. Teniendo en cuenta que algunos de los receptores de la familia del SLAM pueden modular la activación en Mϕ por medio de su asociación con los receptores tipo Toll (TLRs), se analizó la expresión de TLRs implicados en la eliminación de Salmonella. Los resultados mostraron un ligero aumento significativamente mayor en la expresión de tlr2 y tlr4 en ausencia de SLAMF8. No creemos que esta pequeña diferencia sea causante del fenotipo observado, aunque también podría contribuir a ello. También analizamos la expresión de Slamf9, miembro de la familia implicado en la eliminación de este microorganismo, ya que se ha descrito una acción conjunta de éste con SLAMF8 en un modelo de sepsis con LPS, mediante la modulación de la expresión de TLR4. No encontramos diferencias en la expresión de Slamf9 en el modelo de infección con S. typhimurium in vitro. En cambio, sí se observó que, en ausencia de SLAMF8 estaba incrementada la expresión de la citoquina il-6 bajo este modelo de infección, lo que indicaba que, efectivamente SLAMF8 modula la respuesta inflamatoria en Mϕ y por tanto su acción es efectiva durante procesos infecciosos. A continuación, se analizó el papel de SLAMF8 sobre la vía de activación Src quinasa y la fosfatasa SHP-1, por su implicación en procesos de activación de NOX2 e intervención en la activación de mecanismos para la eliminación de microorganismos. Los resultados mostraron una mayor activación de Src quinasas y un detrimento en la activación de la fosfatasa SHP-1 en ausencia de SLAMF8, bajo el modelo de infección con S. typhimurium in vitro. Se observó que el tratamiento con IFNγ en los Mϕ SLAMF8-/- ya incrementa la activación de Src y, además, que bajo el estímulo de S. typhimurium incrementaba aún más la activación de Src quinasas acompañado de un detrimento en SHP-1. Creemos que esto es debido al incremento en la producción de ROS, descrito como activador de Src e inhibidor de SHP1. Todo esto nos lleva a concluir que SLAMF8 también modula el cebado o inicio de activación de los Mϕ, ya que observamos que el tratamiento con LPS o IFNγ ya muestra diferencias en la activación de los mismos. La función de SLAMF8 sobre la activación de los mecanismos microbicidas NOX2 e iNOS y de sus vías de activación en Mϕ de ratón, fueron confirmados por medio de experimentos de sobreexpresión de SLAMF8 murino en la línea celular RAW264.7, en los que se obtuvo un fenotipo contrario al observado en Mϕ deficientes en SLAMF8. Posteriormente, la confirmación de que SLAMF8 presentaba un papel sobre la regulación de los mecanismos microbicidas, se obtuvo por medio del estudio de SLAMF8 sobre la capacidad microbicidad de S. typhimurium in vivo. Los resultados indicaron que ratones deficientes en SLAMF8 presentaban una mayor capacidad microbicida que los WT, y que en ausencia de SLAMF8 hay una reducción de la capacidad proliferativa de S. typhimurium. Estos resultados probablemente sean producidos por la mayor inducción de iNOS y NOX2 detectada en los ratones SLAMF8-/- que, en consecuencia, generarían una menor acidificación del fagosoma ya observada en los Mϕ SLAMF8-/-, que impediría la acidificación acelerada del SCV, efecto utilizado por la bacteria para su replicación. Finalmente dada su función en Mϕ de ratón, se analizó su posible papel en Mϕ humanos. En primer lugar, se determinó por medio de experimentos de sobreexpresión de SLAMF8 humano en la línea celular THP-1, que el efecto de SLAMF8 sobre la regulación de la activación de NOX2 en monocitos humanos era similar al observado en Mϕ de ratón. En segundo lugar, dada la plasticidad de funciones asociada a los Mϕ, se analizó la expresión de SLAMF8 en los subtipos de Mϕ M1 y M2 en humano. Los resultados mostraron que SLAMF8 se expresaba en ambos subtipos de Mϕ, lo que posiblemente era indicativo de una posible implicación de SLAMF8 en la modulación de respuestas pro- y anti-inflamatorias. En resumen, este estudio hace un análisis en profundidad del papel de SLAMF8 en la funcionalidad de los Mϕ. Gracias al conjunto de resultados obtenidos, se confirma que SLAMF8 es capaz de regular negativamente procesos de activación in vitro, y que lo hace a través de su acción moduladora negativa sobre la PI3K en el bucle de retroalimentación de la PKC y PI3K. Además, nuestros resultados indican que SLAMF8 es capaz de modular negativamente mecanismos microbicidas tanto in vitro como in vivo, y que su función en humano puede ser similar a la encontrada en ratón. Esto plantea la posibilidad de su uso como diana terapéutica a través de su intervención para el tratamiento de estados inflamatorios severos o no resueltos.