Polimorfismo y actividad biológica de los inhibidores Bowman-Birk en leguminosas

Resumen

Los inhibidores de la familia Bowman-Birk (BBI) son inhibidores de proteasas de plantas que se encuentran en concentraciones elevadas en leguminosas tales como soja, guisante, lenteja y garbanzo, y que presentan la capacidad de inhibir una o varias serín proteasas, incluyendo las enzimas digestivas tripsina y quimotripsina. Estos inhibidores interaccionan con el sitio activo de la enzima en forma canónica mediante la exposición de sus dominios de inhibición. BBI es capaz de resistir tanto las condiciones ácidas como la acción de enzimas proteolíticas en el estómago e intestino delgado, permitiendo que cantidades fisiológicamente relevantes lleguen al intestino grueso en forma activa, con el fin de ejercer sus propiedades anti-cancerígenas y anti-inflamatorias en el tracto gastrointestinal de mamíferos. La familia BBI presenta polimorfismo a nivel inter- e intraespecífico. Un número limitado de aminoácidos presentes en el dominio de inhibición es responsable de las actividades funcionales y biológicas de las proteínas BBI. Sin embargo, variaciones en la secuencia de los dominios de inhibición, modificaciones postraduccionales en los extremos N- y C-terminal, así como diferencias en la naturaleza multimérica de los inhibidores, pueden influir en las propiedades funcionales y el papel fisiológico de las proteínas BBI. En esta tesis doctoral, una isoforma recombinante de TI1, inhibidor BBI mayoritario en guisante, y mutantes derivados del mismo obtenidos mediante mutagénesis dirigida, con dos dominios de inhibición idénticos frente a la enzima tripsina o quimotripsina, han demostrado influir negativamente en el crecimiento de células HT29 procedentes de adenocarcinoma colorrectal humano in vitro. Sin embargo, un mutante inactivo derivado de TI1, obtenido mediante la sustitución de la posición P1 por glicina en ambos dominios de inhibición, no mostró efecto alguno en la proliferación de células HT29, sugiriéndose que el efecto anti-proliferativo que ejercen las proteínas BBI en células cancerígenas de colon es consecuencia de su capacidad intrínseca de inhibir las actividades proteolíticas de serín proteasas. Como consecuencia, tanto las enzimas de tipo tripsina como las enzimas del tipo quimotripsina involucradas en etapas iniciales de procesos cancerígenos colorrectales deberían ser consideradas como dianas potenciales de las proteínas BBI. Mediante síntesis química, el uso de péptidos cíclicos sintéticos que imitan a los dominios de inhibición de las proteínas BBI puede facilitar la manipulación, el screening y la selección de variantes con potencial terapéutico. Sin embargo, los resultados obtenidos con péptidos cíclicos sintéticos que imitan a los dominios de inhibición de TI1 e IBB1, de guisante y soja, respectivamente, indicaron un descenso significativo de actividad inhibidora respecto a las proteínas parentales y, probablemente como consecuencia, no tuvieron efecto alguno en la proliferación de células HT29. La leche de soja es una bebida beneficiosa para la salud, cuyo consumo está creciendo considerablemente en la población española. Los productos de soja se han asociado con parámetros tales como capacidad antioxidante, propiedades anti-inflamatorias y disminución en el riesgo de desarrollar procesos cancerígenos, debido a su contenido en polifenoles e inhibidores de proteasas, entre otros compuestos bioactivos. El contenido en proteínas BBI de soja ha sido analizado mediante métodos inmunológicos, con los cuales no se consigue diferenciar entre isoformas activas e inactivas. Dado que las propiedades preventivas y terapéuticas de los inhibidores BBI están directamente relacionadas con su capacidad inhibidora, en esta tesis doctoral se ha cuantificado la cantidad de los isoinhibidores BBI, IBB1 e IBBD2, presentes en forma activa en leches de soja comerciales, que pudieran ejercer efectos beneficiosos en los consumidores. Las concentraciones de IBB1 e IBBD2 varían entre 0.44-5.20 y 0.27-4.6 mg por cada 100 mL de leche de soja, respectivamente. Estos datos sugieren que las leches de soja comerciales presentan cantidades fisiológicamente relevantes de BBI activos, pudiendo ejercer efectos beneficiosos para la salud. La actividad inhibidora de tripsina asociada a las proteínas BBI de leguminosas afecta a la digestibilidad proteica y, por tanto, limita el uso de semillas en nutrición animal. Mediante la metodología TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genome), hemos analizado tres mutaciones puntuales en TI1 con las que podemos concluir que (1) la eliminación de uno de los puentes disulfuro cercano al dominio de inhibición C-terminal (C8-C12) es crítico para la inhibición de ambas enzimas, tripsina y quimotripsina; (2) la sustitución del aminoácido serina, presente en la posición P1’ del dominio de inhibición C-terminal, por fenilalanina reduce la inhibición de la enzima quimotripsina y presenta un ligero aumento en la inhibición de tripsina, probablemente debido a cambios conformacionales de la proteína; y (3) el cambio en la carga del extremo C-terminal, como consecuencia de la sustitución de glutámico por lisina, no afecta a las propiedades inhibidoras de la proteína pero podría modificar su capacidad de formar oligómeros, estando este hecho asociado a la estabilidad proteica de los BBI.