Utilización de tecnicas analíticas avanzadas para la determinación de compuestos bioactivos en muestras vegetales

Resumen

En la presente memoria se recogen los resultados obtenidos durante la realización de la tesis doctoral titulada “Técnicas analíticas avanzadas para la determinación de compuestos bioactivos en muestras vegetales”. Los estudios presentados contienen la caracterización y cuantificación de varias familias de compuestos bioactivos, como son los compuestos fenólicos y los compuestos de la fracción lipídica: ácidos grasos, tocoferoles, fitoesteroles y fosfolípidos, en diferentes matrices vegetales y en subproductos derivados de las mismas. En algunos de estos casos, también se ha estudiado la influencia de las condiciones climáticas y el efecto de la temperatura ejerce en la composición fenólica. La memoria consta de una primera parte denominada “INTRODUCCIÓN” que incluye información acerca de las bases científicas en las que se fundamenta la relación dieta-salud y su relación con alimentos de origen vegetal, los compuestos bioactivos procedentes de los vegetales, una descripción detallada sobre las distintas familias de compuestos que han sido objeto de estudio y las diferentes fuentes vegetales de los compuestos bioactivos analizados. A su vez, se exponen los diferentes procedimientos y técnicas utilizadas en la parte experimental, incluyendo el tratamiento de la muestra, metodología para el estudio de la capacidad antioxidante, y técnicas separativas y de detección empleadas en el análisis de los compuestos bioactivos de los diferentes extractos vegetales. En la segunda parte se aborda la sección “PARTE EXPERIMENTAL. RESULTADOS Y DISCUSIÓN”, que está compuesta por ocho capítulos. El capítulo 1, es un trabajo de revisión bibliográfica acerca de las diferentes técnicas de extracción de compuestos fenólicos en muestras vegetales. Se incluye una breve descripción de los distintos tipos de compuestos fenólicos y los sistemas de extracción más comunes, extracción líquido-líquido (LLE), extracción en fase sólida (SFE), extracción con fluidos supercríticos (SFE), extracción con fluidos presurizados (PLE), extracción asistida con microondas (MAE) y extracción asistida con ultrasonidos (UAE). En el capítulo 2 se incluye, el estudio de la capacidad antioxidante de 11 frutas y 13 verduras incluyendo las variedades más comunes cultivadas en Andalucía. Éstos fueron: espárrago (Asparagus officinalis L.), alcachofa (Cynara scolymus L.), zanahoria (Daucus carota L.), berenjena (Solanum melongena L.), haba (Vicia faba L.), ajo (Allium sativum L.), judía verde (Phaseolus vulgaris L.), lechuga (Lactuca sativa L.), cebolla (Allium cepa L.), pimiento (Capsicum annuum L.), patata (Solanum tuberosum L.), tomate (Solanum lycopersicum L.), calabacín (Cucurbita pepo L.), aguacate (Persea americana Mill.), chirimoya (Annona cherimola Mill.), uva (Vitis vinifera L.), limón (Citrus limon (L.) Burm. f.), níspero (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.), mango (Mangifera indica L.), melón (Cucumis melo L.), caqui (Diospyros kaki), granada (Punica granatum L.), membrillo (Cydonia oblonga Mill.), y sandía (Citrullus lanatus (Thunb.) Mansf.). Las técnicas de capacidad antioxidante seleccionadas fueron TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) y ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). El capítulo 3 está dedicado a la determinación de la capacidad antioxidante, mediante los tres métodos descritos en el capítulo 2, y la caracterización del perfil fenólico de un extracto seco de mangostán (Garcinia mangostana), una fruta tropical originaria del sudeste asiático. La caracterización de los compuestos fenólicos fue realizada utilizando CE-TOF-MS. Con el método puesto a punto se detectaron un total de 10 compuestos, principalmente xantonas. En el capítulo 4 se presenta el estudio de la influencia que los procesos tecnológicos tienen en la composición fenólica y la capacidad antioxidante de un extracto seco de limón. Las muestras comparadas fueron un liofilizado y un deshidratado de limón, este último almacenado a una temperatura extrema de 50 ºC y a diferentes tiempos (1 y 3 meses). El estudio de la capacidad antioxidante, se realizó de nuevo usando los tres métodos comentados anteriormente. Para la identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos se utilizó la técnica, HPLC-DAD-ESI-TOF-MS. La información proporcionada por ambos detectores, máximos de absorción, valores de masa exacta, y distribución isotópica ha permitido la identificación tentativa de 23 compuestos. Finalmente se llevó a cabo un análisis de los indicadores de daño térmico, hidroxi-metilfurfural y furfural utilizando HPLC-UV. El capítulo 5 se centra en la identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos en tres variedades diferentes de berenjena (Solanum melongena L.) cultivadas en diferentes estaciones del año. La técnica analítica utilizada en este caso fue HPLC-DAD-QTOF-MS en modo positivo y negativo; el analizador de masas QTOF ofrece una elevada exactitud de los valores de masas y la distribución isotópica tanto de los espectros de masas como los de MS2 permitiendo la identificación de un gran número de compuestos fenólicos. Posteriormente, en función de los resultados obtenidos en la cuantificación de los compuestos, se ha evaluado la influencia de las condiciones climáticas en el contenido polifenólico de las matrices. En el capítulo 6, se incluye el estudio basado en la caracterización y cuantificación de los compuestos fenólicos y otros compuestos polares de dos variedades diferentes de chirimoya y sus subproductos (piel y hueso). Las variedades seleccionadas fueron ‘Fino de Jete’ y ‘Campa’, las más comunes cultivadas en la de la Costa Tropical de Granada-Málaga. Los análisis de las diferentes muestras fueron realizados, de nuevo, mediante HPLC-DAD-QTOF- MS. Se han identificado un total de 21 compuestos en la porción comestible de la fruta (pulpa), 37 en piel y 22 en hueso, de los cuales la mayoría fueron identificados por primera vez en chirimoya. Los compuestos mayoritarios detectados en pulpa y piel fueron principalmente proantocianidinas, mientras que en hueso se encontraron ácidos orgánicos y flavonoides. Los dos últimos capítulos de la tesis se centraron en la determinación de compuestos bioactivos apolares en diferentes matrices. El capítulo 7 recoge la determinación de la fracción lipídica (ácidos grasos, tocoferoles, fitoesteroles y fosfolípidos) de las dos variedades de chirimoya estudiadas en el capítulo anterior, así como en sus subproductos. Se han cuantificado un total de 19 ácidos grasos en la pulpa, piel y hueso de la fruta mediante Fast-GC-FID, las pequeñas dimensiones de la columna capilar utilizada permitieron realizar el análisis de todos los ácidos grasos en un tiempo de 6 minutos, obteniendo una buena resolución. Los tocoferoles fueron determinados mediante HPLC utilizando un detector fluorimétrico, se cuantificaron α y δ-tocoferol en piel y pulpa de las diferentes variedades de la fruta. La técnica GC-Q-MS, se utilizó para la determinación de los esteroles permitiendo la detección de 8 compuestos de esta familia, β-sitosterol fue el compuesto mayoritario en todas las muestras analizadas y por primera vez se identificó γ-sitosterol en piel y pulpa. Finalmente se realizó la determinación de los fosfolípidos y de los ácidos grasos de los fosfolípidos mediante HPLC-ELSD. Por último, en el capítulo 8 se expone el estudio realizado para la caracterización de los compuestos bioactivos en la fracción lipídica encontrados en el aceite extraído de semillas de granada. Para la realización de este trabajo se seleccionaron un total de 17 variedades diferentes de granada de diferentes países, siendo 5 de ellas variedades de árboles no comerciales. Los compuestos objeto de estudio fueron ácidos grasos, tocoferoles, fitoesteroles y fosfolípidos, siendo las técnicas utilizadas, las mismas que las descritas en el capítulo 7. Se han identificado un total de 18 ácidos grasos entre los que se encuentra el ácido punícico (CLnA). Cabe destacar, la identificación de α y β-tocotrienol, determinados por primera vez en este tipo de muestras. En cuanto a los esteroles, de los 5 cuantificados el que se encontró en mayor concentración fue el sitosterol.