Determinación de los requerimientos nutricionales, optimización de las condiciones de cultivo y estabilidad de la biomasa microalgal de nannochloropsis gaditana para su uso en acuicultura

Resumen

La investigación presentada en esta memoria forma parte del trabajo que desarrolla el Grupo de Investigación Biotecnología de Microalgas Marinas del Área de Ingeniería Química de la Universidad de Almería. En concreto, esta Tesis se encuentra integrada en la realización de un proyecto llevado a cabo en el Área de Ingeniería Química del Departamento de Ingeniería de la Universidad de Almería, proyecto de colaboración entre los grupos de Investigación de Biotecnología de Microalgas Marinas (BIO 173) y Automática, Electrónica y Robótica (TEP 197), el Servicio de Piensos Experimentales de la Universidad de Almería y la Estación Experimental Las Palmerillas-CAJAMAR, financiado por la Junta de Andalucía con el Proyecto de Excelencia (P09-5334) titulado Desarrollo de un proceso industrial de producción de microalgas como factor determinante para la acuicultura, y dirigido a la producción de biomasa microalgal de calidad para su uso en acuicultura. Este trabajo está enfocado a la determinación de los requerimientos nutricionales de la microalga Nannochloropsis gaditana con el objetivo de optimizar tanto la formulación de un medio de cultivo de bajo coste como las condiciones de cultivo (temperatura, irradiancia promedio y velocidad de dilución) para maximizar la productividad de biomasa, proteínas y ácido eicosapentaenoico (EPA). Este trabajo también aporta un estudio comparativo de diferentes sistemas de producción de microalgas a gran escala (fotobiorreactores), basado en estudios de sistemas previamente existentes para el acondicionamiento y preparación de medio de cultivo, así como la caracterización de efluentes y desarrollo de métodos de recirculación de medio. Finalmente, se ha evaluado un sistema de almacenamiento y preservación de biomasa a largo plazo como método rápido y práctico de mantenimiento de inóculo de alta concentración para acuicultores o para su uso directo como alimento, con una biomasa de alta calidad. Optimización de los requerimientos nutricionales En lo referente a la optimización de la composición del medio de cultivo se seleccionó el medio de cultivo Algal (Bionova, Santiago de Compostela, España), ampliamente utilizado en el cultivo de microalgas para su uso en acuicultura. Se establecieron como condiciones de cultivo las más frecuentes para la mayoría de microalgas, aunque posteriormente estas condiciones fueron optimizadas de forma individual. En esta primera fase de la optimización de los requerimientos nutricionales, los ensayos se realizaron en columnas de burbujeo de 2 L en modo continuo a una velocidad de dilución de 0,3 d-1 a 25 ºC y con una irradiancia incidente en la superficie del cultivo de 1000 µmols-1m-2. Se evaluó el contenido de macronutrientes, nitrógeno y fósforo, en un amplio rango de concentraciones. Como fuente de nitrógeno se empleó KNO3 en un rango de 2 mM (condiciones de limitación de sustrato) a 16 mM (condiciones repletas de sustrato). Así, la fuente de fósforo fue NaH2PO4, variando su contenido entre 0,11 y 1,90 mM. El valor máximo de productividad de biomasa, 0,56 gL-1d-1, se logró a unas concentraciones de nitrógeno y fósforo 11,3 y 0,16 mM, respectivamente, logrando reducir 4 veces el requerimiento de fósforo respecto al medio de cultivo control (Algal). Se obtuvo una productividad de proteínas y EPA de 261 y 25 mgL-1d-1, respectivamente. Continuando con esta tarea, se evaluó el uso de diferentes fuentes de macronutrientes, tales como NaNO3, Ca(NO3)2, (NH4)2HPO4, basadas en fertilizantes de uso agrícola, así como el empleo de distintas fuentes (Welgro Hydroponic, Welgro Micromix y Codafol) y concentraciones (de 10 a 100 µLL-1) de micronutrientes. Con el empleo de una mezcla de KNO3, KNO3 y Ca(NO3)2 como fuentes de nitrógeno, NaH2PO4 como fuente de fósforo y una 10 µLL-1 de una mezcla 50-50 de Welgro Hydroponic-Welgro Micromix se logró una velocidad de crecimiento, productividad de biomasa y composición bioquímica similares a las conseguidas con el medio de cultivo control. Sin embargo, la composición estandarizada de los fertilizantes agrícolas utilizados no coincidía con los requerimientos de la microalga, produciéndose desequilibrios entre el consumo y el aporte, ya que ciertos nutrientes se encontraban en exceso y otros en defecto. Por ello fue necesario llevar a cabo un estudio adicional con el fin de optimizar el contenido de cada uno de los nutrientes presentes en el medio control mediante un algoritmo genético en cultivo discontinuo, con el objetivo de maximizar las productividades de biomasa y EPA. Se eligió esta metodología ya que permite el trabajo en paralelo con multitud de experimentos (generaciones) en los que se modifica un gran número de variables, que en este caso son las concentraciones de los diferentes nutrientes. Esta experimentación se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer de 100 mL con un volumen de cultivo de 50 mL agitados continuamente con una velocidad de 100 rpm y una iluminación continua a una irradiancia incidente de 166 µmols-1m-2. El rango de concentración de nutrientes varió entre 0 y el valor máximo basado en una concentración de nitrógeno de 1,6 gL-1 con el medio comercial, a excepción del nitrato, que se varió entre 0,8 y 1,6 gL-1 ya que concentraciones inferiores tienen un gran impacto en la productividad de biomasa. Este estudio fue posteriormente validado con experimentos en modo continuo con columnas de burbujeo de 2 L a 25 ºC de temperatura, una irradiancia incidente de 1000 µmols-1m-2 y una velocidad de dilución de 0,3 d-1, en el que se ensayaron los 3 mejores medios propuestos por el algoritmo genético comparándolos con el medio comercial. Se demostró que era factible una reducción del 74, 69 y 66% de los requerimientos de P, Mo y Mn, respectivamente, aumentando a la vez un 23% la productividad de EPA, incrementándose un 40% el rendimiento de EPA en nitrógeno y obteniendo un rendimiento de EPA en fósforo 5 veces superior en referencia al medio control. Optimización de las condiciones de cultivo Una vez optimizado el medio de cultivo se ha realizado un estudio para determinar la influencia de las condiciones ambientales (temperatura, irradiancia) y operacionales (velocidad de dilución) que permitan maximizar el rendimiento de los cultivos de N. gaditana. Con este fin se han llevado a cabo experimentos en continuo en laboratorio en columnas de burbujeo de 2 L en un amplio rango de temperaturas (15-30 ºC), irradiancia incidente (250-1600 µmols-1m-2) y velocidad de dilución (0,1-0,5 d-1) en los que se ha medido la concentración de biomasa y la productividad. En base a estos experimentos, se han desarrollado modelos de productividad de biomasa, EPA y carotenoides (ß-caroteno y vaucheriaxantina) en función de la temperatura e irradiancia promedio de los cultivos. Esta metodología ha permitido determinar que las condiciones óptimas de crecimiento del cultivo y acumulación de estos productos de interés son 25 ºC de temperatura, una irradiancia promedio en el cultivo de 170 µmols-1m-2 y una velocidad de dilución de 0,3 d-1, dando como resultado una productividad de biomasa óptima de 0,429 gL-1d-1 y unas productividades de EPA, ß-caroteno y vaucheriaxantina de 17,2, 1,05 y 1,24 mgL-1d-1, respectivamente. Se ha ensayado el crecimiento de N. gaditana en sistemas de diferentes geometrías (bolsa circular y geometría plana) y fotobiorreactores tubulares cerrados en externo, con el fin de validar el estudio llevado a cabo en interno y estudiar la posibilidad de escalado del cultivo de esta microalga, comparando el uso de sistemas tradicionales (en los que no se controla el pH del cultivo suponiendo un cuello de botella en el desarrollo de esta actividad) con estos mismos sistemas con control de pH. Se ha seguido la evolución de los cultivos a los largo de un año para estudiar el efecto de diferentes condiciones ambientales (temperatura e irradiancia), así como de variables operacionales (velocidad de dilución y control de pH mediante inyección de CO2). En referencia a este estudio se ha concluido que es necesario el control de pH del sistema mediante la inyección de CO2 para incrementar la eficiencia de la productividad de biomasa y la obtención de una biomasa con una composición bioquímica que la haga apta para su uso en acuicultura. Este estudio ha conseguido validar el modelo de acumulación de EPA obtenido en interno. Almacenamiento y estabilidad de biomasa concentrada La última tarea de este trabajo ha consistido en el estudio de la tasa de supervivencia y calidad (enfocado al contenido en PUFAs, principalmente EPA) de biomasa de N. gaditana almacenada bajo diferentes condiciones de preservación para su uso inmediato como alimento directo o como inóculo concentrado para ser utilizado de manera inmediata en fotobiorreactores. Las condiciones de almacenamiento que se han ensayado han permitido estudiar el efecto de diferentes parámetros, tales como el tiempo de almacenamiento, la concentración inicial de los cultivos, la presencia o ausencia de luz en los cultivos, la adición de agentes de preservación (estreptomicina, penicilina G y ácido ascórbico) o diferentes atmósferas de conservación, como aire y N2-CO2 en diferentes proporciones (100-0, 50-50, 30-70, 0-100), en la viabilidad celular, la evolución de la concentración de las muestras, la carga bacteriana, la actividad fotosintética celular, así como el contenido y perfil de ácidos grasos, clorofilas y carotenoides. Estos experimentos se han llevado a cabo empleando un sencillo sistema que pretende demostrar la posibilidad de mantener, en un único paso y durante un periodo de 4-5 meses, unas muestras que permitan a los acuicultores usarlo fácil y rápidamente para disponer de importantes volúmenes de biomasa microalgal fresca con recursos limitados y una infraestructura de bajo coste. Los resultados permiten concluir que muestras de Nannochloropsis gaditana a una concentración inicial de 5 gL-1 pueden ser almacenadas durante 5 meses a 4 ºC con adición periódica de agentes preservadores con el fin de mantener una baja carga bacteriana, una iluminación de 35 µmols-1m-2 (que preserva la actividad fotosintética celular) y bajo atmósferas de nitrógeno o aire, manteniendo un contenido de EPA estable de 3,6% (peso seco, p.s.) y un contenido de pigmentos de 0,85% (p.s.). En el caso de pastas concentradas a una concentración inicial de 150 gL-1, preservadas bajo las mismas condiciones de almacenamiento, tienen un tiempo de vida útil de 4 meses y una composición bioquímica similar.