Sobre-expresion de enzimas hidantoinasa y carbamilasa

Résumé

El presente trabajo aporta la investigacion, resultados y discusión de la sobre-expresion de enzimas hidantoinasa y carbamilasa, utilizada en la sintesis de D y L-aminoacidos a partir de mezclas racemicas de hidantoinas. Varios aminoacidos se producen a escala industrial para su utilización en farmacia, alimentacion, agricultura, etc. Se pusieron a punto dos de las condiciones de medida de actividad hidantoinasa y carbamilasa de las diversas cepas utilizadas: la relación biomasa húmeda/tiempo de reacción y la permeabilizacion celular. Se estudiaron varias cepas silvestres para seleccionar aquellas con las enzimas hidantoinasa, D-carbamilasa y L-carbamilasa más adecuadas para su utilización futura a escla industrial. Las cinco enzimas escogidas industrial. Las cinco enzimas escogidas fueron clonadas y sobre-expresadas en Escherichia coli y Agrobacterium tumefacines. Se realizaron estudios preliminares de medida de actividad enzimática con todos los organismos recombinantes obtenidos y se escogieron tres en los que incrementó (utilizando IPTG como inductor) la actividad respecto a la de las cepas silvestres. Los tres microorganismos fueron E.coli BL21 (DE3) con la D-carbamilasa de Agrobacterium tumefaciens A158 bajo control del promotor 010 del vector pBSK y E. Coli DH5a con la L-carbamilasa de Bacillus stearothermophilus A245 bajo control del promotor lac del vector pBSK y E.coli DH5a con la hidantoinsasa de Agrobacterium tumefaciens A244 bajo control del promotor lac del vector pBSK. Con dichos organismos se llevaron a cabo experimentos de optimizacion de la expresión de las enzimas mediante diseño experimental y fermentaciones de laboratorio, a fin de obtener la maxima actividad enzimática y crecimiento posibles sin utilizar IPTG ni antibiotico.