Aplicación de la técnica Speed Oligo al estudio de la tuberculosis

Resumen

Introducción y Objetivos La tuberculosis es todavía una de las principales causas de muerte en adultos a nivel mundial.Está causada por las especies de complejo M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG, M.africanum, M.caprae, M.microti, M.canettii y M.pinnipedii). El diagnóstico precoz de la tuberculosis es esencial para el control de la enfermedad, con el fin de interrumpir la cadena de transmisión y poder administrar una correcta terapia antibiótica. Para ello se han desarrollado diferentes métodos moleculares que detectan e identifican el complejo M. tuberculosis directamente en muestras de forma mucho más rápida que por cultivo de modo que se consigue evitar el retraso diagnóstico. En este trabajo se evaluó la técnica comercial Speed Oligo® Direct Mycobacterium tuberculosis (SO-DMT) para la detección de micobacterias en muestras clínicas respiratorias. Todas las especies del complejo comparten el 99,9% de identidad en las secuencias genéticas pero difieren ampliamente en sus tropismos por el hospedador, fenotipos y patogenicidad. La identificación a nivel de especie es importante desde el punto de vista epidemiológico y para establecer un correcto tratamiento. Para ello clásicamente se han utilizado pruebas bioquímicas pero la lentitud de este procedimiento, la subjetividad en la lectura de las pruebas y la baja reproducibilidad de éstas las hacen inviables hoy en día. Por esto nos propusimos diseñar una técnica de amplificación de ácidos nucleicos para diferenciar a los miembros del complejo M.tuberculosis (Speed Oligo® Mycobacterium tuberculosis complex (SO-MTBC)), adecuando la técnica al formato Speed Oligo® previamente comercializado por la empresa Vircell. Este formato se basa en la combinación de un método de amplificación por PCR con un procedimiento de detección simple en un dipstik mediante el uso de sondas. Los resultados se obtienen en 90 minutos. Además se realizó un estudio de carácter retrospectivo de los casos de tuberculosis diagnosticados en el Área Norte de Granada durante los años 2011-2014, para conocer las características clínico epidemiológicas de los pacientes. Materiales y métodos Se realizó el ensayo SO-DMT a 249 muestras clínicas respiratorias de 199 pacientes con sospecha de tuberculosis recibidas en el laboratorio entre los meses de abril a junio de 2011. Los resultados obtenidos con Speed Oligo® DTM se compararon con el cultivo en medio líquido BACTEC MGIT y las técnicas de identificación utilizadas en el laboratorio de forma habitual. Se identificaron las posibles zonas del genoma que fueran diferentes entre las micobacterias del complejo y que pudieran servir como diana de la técnica molecular y se diseñaron oligonucleótidos para amplificar las zonas del genoma elegidas. Posteriormente se diseñaron las sondas necesarias para proceder a la detección del producto de amplificación en una tira de nitrocelulosa. Para la validación del SO-MTBC se analizaron 189 cepas clínicas de pacientes diagnosticados con tuberculosis, previamente identificadas como M.tuberculosis complex. Los resultados obtenidos se compararon con el ensayo comercial Genotype MTBC® (Hain Lifesciencience). Para comprobar la especificidad de la técnica se analizaron 25 cepas clínicas de micobacterias no tuberculosas (MNT) y con bacterias de otros géneros relacionados. Para la realización del estudio clínico epidemiológico de los pacientes se consultaron varios sistemas de información (Historia Clínica, Datos de la delegación, programa informático del Laboratorio de Microbiología) y se construyó una base de datos estudiando variables sociodemográficas (edad, sexo, nacionalidad) y relativas a su enfermedad (forma clínica, evolución, tratamiento, muestras para diagnóstico, hospitalización, estudio de contactos). Resultados La sensibilidad del SO-DMT con respecto al cultivo para detectar M.tuberculosis complex en muestras clínicas respiratorias fue del 100%; sin embargo la sensibilidad para detectar las micobacterias no tuberculosas fue del 33,3% Se obtuvo un posible algoritmo diagnóstico para diferenciar los miembros del complejo M.tuberculosis utilizando como diana 4 regiones de delección (RDs) del genoma de las distintas especies con respecto a M.tuberculosis. Estas regiones son: RD1, RD4, RD9, RD12 e ITS. La especificidad de la técnica fue del 100%. En el análisis de 189 cepas clínicas previamente identificadas como M.tuberculosis complex se obtuvieron los siguientes resultados: el 92,1% (174) de las cepas del complejo analizadas fueron M.tuberculosis; el 3,7% (7) corresponde a M.bovis; un 2,6% (5) fueron M.bovis BCG; 1,1% (2) M.africanum y 0,5% (1) M.caprae. No se encontró ninguna especie de M.microti ni M.canettii. La concordancia entre el SO-MTBC y Genotype MTBC® medida con el índice Kappa de Cohen fue de 0,9589 con un IC del 95%. En el área sanitaria Norte de Granada, se diagnosticaron 297 casos de tuberculosis durante el periodo de estudio (de enero de 2011 a diciembre de 2014), lo que corresponde a una tasa de incidencia anual media de 22,40 casos por 100.000 habitantes. La media de edad de los pacientes fue de 41 años [1-91]. En cuanto al sexo, el 38,05% (113) de los pacientes fueron mujeres mientras que el 61,95% (184) fueron hombres. Los pacientes españoles supusieron un 74,07% (220) del total. El restante 25,93% (77) eran extranjeros. Los principales países de origen inmigrante fueron: Marruecos; Rumanía y Senegal que entre estos suman el 66,23% de los pacientes extranjeros. La clínica de la enfermedad fue en un 77,10% (229) tuberculosis respiratoria. Los factores de riesgo más frecuentemente encontrados fueron el alcoholismo, tabaquismo, coinfección con el virus VIH, toxicomanías, diabetes inestable, adicción a drogas por vía parenteral (ADVP). Conclusiones El uso del SO-DMT como herramienta diagnostica a partir de muestras clínicas respiratorias ha mostrado una excelente sensibilidad y especificidad para muestras con baciloscopia positiva, permitiendo la diferenciación entre M.tuberculosis y micobacterias no tuberculosas (MNT) y haciendo posible la obtención de resultados en un periodo corto de tiempo, lo cual ayuda a la instauración precoz del tratamiento antibiótico necesario para los casos de tuberculosis. Las dianas genéticas utilizadas para el desarrollo del SO-MTBC (RD1, RD4, RD9 y RD12) han permitido diferenciar cada uno de los componentes del complejo de una manera eficaz, presentando un mínimo número de discrepancias al comparar el resultado obtenido en cepas clínicas con el Kit GenoType® MTBC. Así mismo la especificidad del SO-MTBC fue excelente. La incidencia de tuberculosis en nuestra población estudio fue superior a la declarada en España, no mostrando variaciones significativas a lo largo de los años de estudio (2011- 2014).