Colonización, seguridad y tolerancia de lactobacillus paracasei cncm i-4034, lactobacillus rhamnosus cncm i-4036 y bifidobacterium breve cncm i-4035 en adultos sanos y sus efectos sobre el metabolismo y sistema inmunitario en ratas zucker

Resumen

COLONIZACIÓN, SEGURIDAD Y TOLERANCIA DE Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 Y Bifidobacterium breve CNCM I-4035 EN ADULTOS SANOS Y SUS EFECTOS SOBRE EL METABOLISMO Y SISTEMA INMUNITARIO EN RATAS ZUCKER" INTRODUCCIÓN El nivel de salud de los individuos está condicionado primordialmente por factores genéticos y ambientales. De estos últimos, la variable externa más importante es la alimentación. Una alimentación apropiada debe satisfacer diariamente las necesidades nutricionales individuales, e incorporar valores culturales, gastronómicos y de satisfacción personal. Estudios recientes en el ámbito de la nutrición humana demuestran que los desajustes alimentarios son la principal causa del desarrollo precoz de la mayor parte de las enfermedades crónicas o degenerativas en la sociedad actual. Por lo tanto, en nuestra mano está la posibilidad de incorporar buenos hábitos de vida, un mejor perfil alimentario y conseguir una disminución global de los factores de riesgo existentes en la población (Plaza-Díaz et al., 2013). En el tratamiento de algunas patologías digestivas se ha comenzado a introducir nuevas estrategias basadas en el uso de probióticos, ¿microorganismos vivos no patógenos que, ingeridos en cantidades suficientes, modulan o actúan sobre determinadas funciones del organismo, produciendo un efecto beneficioso, más allá del puramente nutricional, como contribuir al equilibrio de la microbiota intestinal del hospedador y potenciar el sistema inmunitario¿ (FAO, 2002). En general, éstos suelen ser bacterias lácticas del género Bifidobacterium, Lactobacillus, una mezcla de ellas u otros microorganismos que pueden ser empleados en adultos y niños. Para que una bacteria pueda ser considerada ¿probiótica¿ es necesario que supere diferentes etapas: su aislamiento, identificación, caracterización y evaluación. La identificación de los microorganismos es el primer paso en la selección de potenciales probióticos. Las nuevas técnicas de biología molecular permiten discriminar, con diversos grados de éxito, bacterias estrechamente relacionadas. Métodos moleculares adicionales, tales como la electroforesis en gel de gradiente y la fluorescencia mediante hibridación in situ (por sus siglas en inglés fluorescent in situ hybridization, FISH), se emplean para identificar y caracterizar éstas nuevas bacterias. Uno de los beneficios clínicos mejor demostrados de los probióticos es la prevención y el tratamiento de la diarrea aguda asociada a los antibióticos. No obstante, hay cada vez más evidencia de su beneficio en el tratamiento de alergias, enfermedades metabólicas e intestinales. Existen varios mecanismos propuestos por los que los probióticos ejercen sus efectos beneficiosos, ya sea por la regulación de la permeabilidad intestinal, la mejora de la función barrera y el equilibrio entre citoquinas pro y anti-inflamatorias. En la actualidad, hay un gran número de estudios llevados a cabo in vitro y en animales para probar los efectos de los probióticos. Sin embargo, el método más fiable para evaluar los beneficios terapéuticos de cualquier cepa probiótica es el uso de ensayos aleatorizados en humanos controlados por placebo (Fontana et al., 2013). FUNDAMENTO Y OBJETIVOS Recientemente, nuestro grupo ha identificado y caracterizado tres nuevas cepas probióticas, Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, Bifidobacterium breve CNCM I-4035 y Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, que se aislaron de heces de niños alimentados exclusivamente con leche materna (Muñoz-Quezada et al., 2013). Tras una evaluación inicial de las tres cepas en modelos in vitro, el Instituto Pasteur (Vieites Fernández et al., 2010) las calificó como bacterias nuevas. El objetivo general de este trabajo fue evaluar la seguridad, tolerancia y efectos de las 3 cepas probióticas sobre el sistema inmunitario tanto de voluntarios sanos como de ratas obesas Zucker (fa/fa). Para ello los objetivos específicos fueron: 1. Evaluar la seguridad y tolerancia de las tres cepas probióticas en individuos sanos. 2. Investigar los efectos de las tres cepas sobre el sistema inmunitario de individuos sanos. 3. Determinar si la administración de las tres cepas probióticas modificó las poblaciones microbianas de los voluntarios sanos. 4. Evaluar el efecto de la ingesta de las cepas probióticas sobre valores antropométricos y el perfil lipídico en ratas obesas. 5. Determinar el efecto de la ingesta de las tres cepas probióticas sobre biomarcadores de riesgo cardiovascular e inflamación de ratas obesas. 6. Determinar el efecto de la ingesta de las tres cepas probióticas sobre la esteatosis hepática y su efecto sobre los niveles séricos de lipopolisacárido en ratas obesas. METODOLOGÍA Y RESULTADOS En el presente trabajo se ha realizado un estudio multicéntrico, aleatorizado, doble ciego y controlado por placebo con 100 individuos sanos de tres ciudades españolas, en donde se ha evaluado la tolerancia, seguridad, colonización intestinal y efectos inmunomoduladores de estas tres cepas probióticas. Los voluntarios se sometieron a un primer período de lavado de 15 días y seguidamente fueron divididos aleatoriamente en cinco grupos para recibir diariamente un placebo, una cápsula que contenía una de las tres cepas, o bien una mezcla de Bifidobacterium breve CNCM I-4035 y Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 durante 30 días. Tras la intervención, hubo un segundo lavado de 15 días. Los voluntarios no consumieron ningún producto que contuviera alguna otra cepa probiótica, ni productos fermentados, durante la totalidad del estudio. Los síntomas gastrointestinales, la frecuencia y la consistencia de las heces no se alteraron por la ingesta de ninguna cepa probiótica. No se observaron cambios relevantes en la sangre ni el suero de los voluntarios, ni eventos adversos en la totalidad del estudio. La administración de las cepas probióticas modificó ligeramente las poblaciones bacterianas de las heces de los voluntarios. La persistencia intestinal ocurrió en los voluntarios que recibieron la cepa Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036. La administración de Bifidobacterium breve CNCM I-4035 aumentó significativamente el contenido de IgA secretora en heces. Las concentraciones séricas de IL-4 e IL-10 aumentaron, mientras IL-12 disminuyó, en el los voluntarios que recibieron probióticos. Estos resultados demuestran que el consumo de las tres cepas bacterianas es seguro y que ejercen efectos inmunomoduladores. Por otro lado, se ha evaluado el efecto de estas cepas en la esteatosis hepática de ratas obesas, y el efecto inmunomodulador de dichas cepas. Se utilizaron ratas Zucker como modelo genético de obesidad. Las ratas Zucker recibieron una de las tres cepas, una mezcla de L. paracasei CNCM I-4034 y B. breve CNCM I-4035, o bien un placebo durante 30 días. No hubo alteraciones en la histología intestinal de ninguno de los grupos experimentales. El contenido de triacilglicéridos hepáticos disminuyó significativamente en las ratas Zucker obesas que recibieron L. rhamnosus CNCM I-4036, B. breve CNCM I-4035 y la mezcla de B. breve CNCM I-4035 y L. paracasei CNCM I-4034. También, el área correspondiente a los lípidos neutros fue significativamente menor en los hígados de todos los grupos de ratas Zucker obesas que recibieron alguna cepa probiótica, comparado con las ratas obesas que recibieron placebo. Cabe destacar que las ratas Zucker obesas que recibieron placebo tenían mayor contenido de lipopolisacárido (LPS) sérico comparado con las ratas Zucker obesas que recibieron probióticos. Por lo que se refiere a efectos inmunomoduladores, los valores séricos de TNF-¿ disminuyeron en las ratas Zucker obesas que recibieron L. rhamnosus CNCM I-4036, B. breve CNCM I-4035 y la mezcla de B. breve CNCM I-4035 y L. paracasei CNCM I-4034, mientras que las ratas que recibieron L. paracasei CNCM I-4034 presentaron menores valores séricos de IL-6. En conclusión, las cepas probióticas redujeron la esteatosis hepática en parte debido a la disminución sérica de lipopolisacárido y demostraron poseer cierto efecto antiinflamatorio en las ratas Zucker obesas. DISCUSIÓN Estudio en humanos Los síntomas gastrointestinales (recogidos con las tablas de síntomas diarios y en el cuestionario de calificación de síntomas gastrointestinales), así como la frecuencia y consistencia de las deposiciones no se alteraron en los individuos sanos que ingirieron alguna de las cepas evaluadas, cuando se comparó cada variable con el grupo que recibió el placebo durante 30 días. Igualmente, no se observaron cambios adversos durante o después de la intervención. Estudios similares que evaluaron la seguridad de la administración de cepas probióticas en individuos sanos también han demostrado no producir eventos adversos gastrointestinales graves, ni cambios hematológicos significativos (Wind et al., 2010; Ulsemer et al., 2012; Zhang et al., 2013). Este primer punto merece ser destacado, ya que se cumple el primer objetivo del trabajo que se refiere a la seguridad y tolerancia de las cepas probióticas en individuos sanos. Además, estos resultados complementan los datos obtenidos con anterioridad en el estudio de la resistencia frente a antibióticos de las cepas (Plaza-Diaz et al., 2013), que demostraron que todas fueron sensibles a tetraciclina y ampicilina, lo que permite prevenir el desarrollo de posibles infecciones (Wind et al., 2010). La seguridad y la tolerancia son puntos importantes a la hora de establecer posibles utilidades futuras de las cepas. La oportunidad de evaluar las cepas probióticas en otros tipos de estudios, ya no con pacientes sanos, sino con alguna patología y/o diferentes grupos etarios que permitan conocer y verificar los efectos observados, es un paso que debe ser considerado en el futuro. Con respecto a la persistencia, L. rhamnosus CNCM I-4036 fue la única cepa que pudo ser identificada al finalizar la intervención en las muestras de heces de los voluntarios que la tomaron. Estos resultados no necesariamente implican una colonización exitosa, sino más bien una persistencia de la cepa en el período de tiempo evaluado. La detección en heces de L. rhamnosus CNCM I-4036 tras un período de tiempo mayor (dos semanas después de finalizar la intervención) podría ayudar a determinar si la cepa pudo de hecho colonizar el tracto gastrointestinal. Cabe destacar que el uso de nuevas tecnologías, como la secuenciación masiva, podrían ser útiles para clarificar este asunto. La persistencia en las heces de los voluntarios que recibieron las restantes cepas, L. paracasei CNCM I-4034 y B. breve CNCM I-4035 no pudo ser llevada a cabo debido a la falta de medios de cultivo específicos y selectivos. Es importante destacar que, en nuestro estudio, la administración de las cepas probióticas modificó las poblaciones bacterianas en las heces de los voluntarios, de acuerdo con los datos obtenidos mediante PCR a tiempo real y FISH. Las poblaciones bacterianas modificadas por las cepas bacterianas fueron: Clostridium coccoides, Lactobacillus, Clostridium leptum, Streptococcus y Clostridium perfringens y Clostridium difficile. Algunas de estas modificaciones fueron transitorias, cuando se evaluaron dos semanas después de la intervención. Al observar las poblaciones bacterianas en las heces, se aprecia que los cambios producidos fueron pequeños, pero hay que recordar que los individuos seleccionados en el estudio eran sanos y no presentaron ninguna patología durante y después del estudio. Uno de los hallazgos más relevantes del trabajo fue el aumento de la población de Clostridium difficile que se produjo en las heces de los voluntarios que recibían L. rhamnosus CNCM I-4036 al evaluar las dos semanas siguientes de finalizado el estudio, suponemos que la cepa L. rhamnosus CNCM I-4036 pudo haber evitado el aumento de Clostridium difficile durante la intervención y el hecho de finalizar la administración produjo tal aumento. Este hecho pudo ser debido a que los voluntarios experimentasen un desplazamiento de C. difficile durante los 30 días de intervención con L. rhamnosus CNCM I-4036. Varios estudios han demostrado una disminución en la adhesión de C. difficile a la mucosa intestinal causada por probióticos (Gorbach et al. 1987). El recuento de bifidobacterias también disminuyó en el grupo tratado con L. rhamnosus CNCM I-4036 cuando se compararon las dos semanas después de la intervención y el primer lavado. La disminución del número total de de bifidobacterias en el grupo de voluntarios tratado con B. breve CNCM I-4035 sugiere que la cepa administrada no alcanzó un estado viable en un número significativo en el colon, o bien no proliferó en el mismo (Guarner y Magaleda, 2003). Sorprendentemente, ciertas poblaciones bacterianas cambiaron en las heces de los voluntarios que recibieron el placebo. Este efecto pudo deberse a su composición (leche de vaca y/o sacarosa). El hecho de que los linfocitos T reguladores estuvieran aumentados en el grupo placebo también es intrigante. Estos dos datos, junto con la disminución de la IL-4 en el suero del grupo placebo, pueden indicar que el tamaño de la muestra, a pesar de haber sido calculado a priori, no fue el adecuado para las tres variables mencionadas. Otro importante hallazgo de este trabajo fue que la administración de B. breve CNCM I-4035 resultó en un aumento significativo en el contenido de IgA secretora en heces, tras los 30 días de intervención. Dicho incremento de IgA secretora retornó a los valores iniciales dos semanas despés de finalizar la intervención, lo que apunta a un claro efecto debido a los probióticos. Este resultado confirma hallazgos previos de nuestro grupo (Muñoz-Quezada et al., 2013), que describió que B. breve CNCM I-4035 aumenta las concentraciones de IgA en heces y en plasma de ratones (Muñoz-Quezada et al., 2013). La modificación producida en la IgA secretora tiene un claro e importante efecto en el sistema inmunitario, pues la IgA secretora funciona como una primera línea de defensa en la protección del epitelio intestinal frente a toxinas entéricas y microorganismos patógenos (Mantis et al., 2011). En la actualidad, se ha sugerido que la seguridad de los probióticos debe ser evaluada por los cambios producidos en parámetros del sistema inmunitario, pues hay una evidencia clara de que estos microorganismos, especialmente los pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, pueden tener ciertas propiedades inmunomoduladores (Ashraf y Shah, 2014). El principal hallazgo de nuestro análisis de citoquinas fue que L. paracasei CNCM I-4034, B. breve CNCM I-4035 y L. rhamnosus CNCM I-4036 exhibieron efectos inmunomoduladores en los pacientes que recibieron las cepas cuando se compararon los tiempos finales (t2) e iniciales (t1) de la intervención. Así, los niveles de algunas moléculas antiinflamatorias (IL-4 e IL-10) aumentaron en el suero de los voluntarios que tomaron L. rhamnosus CNCM I-4036, mientras el índice proinflamatorio TNF-¿/IL-10 disminuyó en el mismo grupo de voluntarios. Del mismo modo, la IL-12 (proinflamatoria) disminuyó en voluntarios que recibieron B. breve CNCM I-4035, y el índice antiinflamatorio (IL-10/IL-12) aumentó en el grupo que recibió L. paracasei CNCM I-4034. Estudio en ratas Zucker Al igual que ocurrió en nuestro estudio con voluntarios sanos (Plaza-Diaz et al., 2013), la administración de las tres cepas probióticas a las ratas Zucker fue segura, pues la histología intestinal no mostró alteraciones ni diferencias entre las ratas que recibieron el placebo y las que recibieron alguna de las distintas cepas durante los 30 días de intervención. Además, la administración de las cepas probióticas no afectó a los parámetros bioquímicos, la resistencia a la insulina ni tampoco al perfil de adipoquinas séricas. Estos hallazgos coinciden con los resultados obtenidos en el estudio de intervención realizado en voluntarios sanos (Plaza-Diaz et al., 2013). El principal resultado de esta parte del estudio fue la reducción de la esteatosis hepática observada en las ratas que recibieron alguna cepa probiótica. Las ratas Zucker-Leprfa/fa que recibieron L. rhamnosus CNCM I-4036, B. breve CNCM I-4035 o la mezcla de B. breve CNCM I-4035 y L. paracasei CNCM I-4034 presentaron un menor contenido de triacilgliceroles (TG) hepáticos que las ratas que fueron alimentadas con el placebo durante 30 días. Además, dado que la administración de L. paracasei CNCM I-4034 no disminuyó la cantidad de TG en el hígado, la disminución de los TG hepáticos por la mezcla de los dos probióticos puede atribuirse a la cepa B. breve CNCM I-4035. Esta disminución en el contenido de TG hepáticos no puede ser atribuida a una disminución en la concentración de insulina en suero porque la insulinemia fue similar en las ratas Zucker-Leprfa/fa que recibieron placebo y las cepas. La tinción con Oil red O de los lípidos hepáticos neutros confirmó estos hallazgos. Resultados similares han sido descritos por otros autores. La administración de probióticos produjo una disminución de TG y colesterol hepáticos en ratones y ratas alimentados con una dieta alta en grasa. (Cani et al., 2009; Yoo et al., 2013). Sin embargo, ésta es la primera vez que se describe el efecto de probióticos en la disminución del contenido hepático de TG en un modelo genético de obesidad. Existe gran evidencia que señala que componentes bacterianos pueden afectar el metabolismo del hígado y, por lo tanto, causar enfermedades sistémicas (Delzenne y Cani, 2011, Nolan 1979). Se ha propuesto que los niveles en suero de LPS aumentan en obesidad y esteatosis, produciendo una endotoxemia metabólica capaz de modular las citoquinas proinflamatorias, así como la glucosa y el metabolismo lipídico en el hígado o en el tejido adiposo (Cani y Delzenne 2009). La endotoxemia tiene un papel importante en la inducción de la inflamación hepática en la esteatohepatitis no alcohólica y en la enfermedad de hígado graso no alcohólico en los seres humanos (Adachi et al., 1995). Cani et al. han demostrado alteraciones de la función de barrera intestinal en modelos genéticos de obesidad (Cani et al., 2009). En conjunto, estos estudios sugieren una relación directa entre la microbiota intestinal, la barrera intestinal y alteraciones hepáticas. Este efecto reductor de la esteatosis que observamos en nuestro estudio puede estar mediado, al menos en parte, por la disminución de LPS en el suero observada en las ratas obesas que recibieron alguna cepa probiótica. En general, nuestros resultados apoyan la evidencia actual de que la microbiota intestinal puede afectar al metabolismo hepático (Delzenne y Cani, 2011; Nolan, 1979). Asimismo, se han encontrado claros efectos antiinflamatorios mediados por los probióticos en este estudio: 1) La disminución de los niveles séricos de TNF-¿ en las ratas Zucker-Leprfa/fa obesas que recibieron L. rhamnosus CNCM I-4036, B. breve CNCM I-4035 o la mezcla de B. breve CNCM I-4035 y L. paracasei CNCM I-4034 comparados con las ratas Zucker-Leprfa/fa obesas que sólo tomaron placebo; y 2) La disminución en la concentración sérica de IL-6 en las ratas obesas que recibieron L. paracasei CNCM I-4034 comparados con las ratas obesas que tomaron placebo. En el presente estudio la administración de L. paracasei CNCM I-4034 disminuyó las concentraciones séricas de citoquinas proinflamatorias como IL-6. CONCLUSIÓN Los resultados obtenidos en esta Tesis indican que las cepas probióticas Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, Bifidobacterium breve CNCM I-4035 y Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, son seguras y bien toleradas por individuos sanos. Presentan efectos inmunomoduladores tanto en el estudio realizado en las ratas Zucker-Leprfa/fa como en el estudio clínico, afectando la homeostasis intestinal, gracias a la liberación de citoquinas antiinflamatorios como la IL-10 y la producción de IgA. Finalmente, nuestros resultados sugieren la necesidad de continuar la investigación con las cepas probióticas para probar los efectos encontrados en otro tipo de estudios, que tal vez puedan incluir voluntarios con patologías de tipo inflamatorio. REFERENCIAS Adachi Y, Moore LE, Bradford BU, et al. (1995) Antibiotics prevent liver injury in rats following long-term exposure to ethanol. Gastroenterology 108: 218-224. Ashraf R and Shah NP (2014) Immune system stimulation by probiotic microorganisms. Crit Rev Food Sci Nut. 54:938-56. Cani PD and Delzenne NM (2009) The role of the gut microbiota in energy metabolism and metabolic disease. Curr Opin Pharmacol 15: 1546-1558. Cani PD, Possemiers S, Van de WT, et al. 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