Avocado (persea americana)complementarity of different omics technologies to its metabolic characterization

Resumen

El aguacate es una fruta tropical cada vez más valorada por los consumidores, no sólo por su particular sabor y textura, sino por los posibles efectos beneficiosos para la salud de quien la consume. Esto, acompañado de unas condiciones climáticas muy favorables para su crecimiento, explica que su cultivo se haya extendido en ciertas zonas costeras de Andalucía, situando a España entre los principales países productores y exportadores de este alimento. Las evidencias que confirman los efectos saludables de esta fruta han provocado un aumento de las investigaciones biomédicas/nutricionales donde se evalúan sus propiedades. Sin embargo, un paso previo y absolutamente necesario para la realización de esos estudios es conocer en profundidad la composición de aquello que comemos, hecho que ayuda de manera considerable a comprender sus efectos fisiológicos. Si bien la fracción lipofílica del aguacate había sido estudiada bastante en detalle y se habían publicado diferentes artículos donde se ponía de manifiesto la presencia de proteínas, azúcares, vitaminas, esteroles, taninos, aminoácidos o ácidos grasos en esta matriz, su composición en lo referente a compuestos bioactivos y otros fitoquímicos era bastante desconocida cuando se comenzó la presente Tesis Doctoral. La diversidad química de los metabolitos presentes en este fruto, junto con ciertos procesos (como el de maduración) que provocan que sus concentraciones varíen con el tiempo, hacen que la completa caracterización del metaboloma del aguacate sea una tarea difícilmente alcanzable. No existe ninguna metodología analítica que sea capaz de dar una visión completa del metaboloma de ningún sistema biológico. Esto nos hizo considerar que el uso combinado de aproximaciones targeted and non-targeted (empleando en ambos casos varias herramientas analíticas) podría representar una estrategia adecuada para intentar caracterizar el metaboloma del aguacate, así como sus cambios dinámicos. Por tanto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral, titulada ¿Aguacate (Persea americana): Complementariedad de distintas tecnologías ómicas para su caracterización metábolica¿, es llevar a cabo la caracterización metabólica del aguacate empleando diferentes aproximaciones y herramientas ómicas. La memoria se ha dividido en dos secciones principales: introducción y parte experimental, resultados y discusión. En la Introducción, la primera parte recoge una visión general de la matriz objeto de estudio, desde el origen y estudio botánico del aguacate hasta su producción y consumo a nivel mundial, aunque se presta especial atención a la composición de esta fruta tropical ¿la cual ha sido relacionada con distintos efectos beneficiosos para la salud humana¿ y a todas las plataformas analíticas que se han utilizado para su caracterización. En segundo lugar, se muestra un resumen de las distintas ciencias ómicas, centrándonos en la importancia de los estudios metabolómicos en las investigaciones que se llevan a cabo actualmente en distintos ámbitos, así como en las distintas etapas que componen el flujo de trabajo habitual y las diferentes estrategias analíticas que se pueden seguir. La segunda parte de la memoria hace referencia a la Parte Experimental. Resultados y discusión y está dividida en tres secciones temáticas, relacionadas con las metodologías analíticas puestas a punto para la caracterización del aguacate, cada una de las cuales consta de varios capítulos y una breve introducción. Es importante mencionar que los capítulos recogidos en este bloque de la tesis no siguen un orden cronológico y están numerados de manera consecutiva independientemente de la sección en la que se encuentren. La primera sección versa sobre la aplicación de CE como técnica separativa acoplada a diferentes detectores para identificar y cuantificar varios metabolitos polares en extractos de aguacate. Está formada por tres capítulos, siendo el primero de ellos (Capítulo 1) una revisión bibliográfica que incluye todos aquellos métodos de electroforesis capilar publicados hasta 2010 para el análisis de compuestos fenólicos antioxidantes en alimentos derivados de plantas. Las plantas son importantes fuentes de este tipo de sustancias, las cuales han sido ampliamente estudiadas en los últimos años por sus potenciales efectos saludables. El segundo (Capítulo 2) incluye la optimización de un método CE-UV sensible y eficaz para el análisis de diversos ácidos fenólicos en 13 variedades de aguacate en dos estados de maduración, recién cogidos del árbol y listos para ser consumidos. Todas las variables involucradas tanto en la separación electroforética como en la detección UV fueron optimizadas exhaustivamente. El método fue completamente validado y aplicado con éxito al análisis de las muestras de aguacate. Fue posible llevar a cabo la identificación de un número considerable de ácidos fenólicos, que osciló entre 8 y 14 compuestos dependiendo de la variedad, los cuales se encontraron en concentraciones variables. En general, compuestos como los ácidos p-coumárico, benzoico y protocatecuico resultaron ser los más abundantes en los extractos de aguacate maduro. Se realizó el análisis de componentes principales para evaluar las diferencias existentes entre las distintas variedades y los estados de maduración, destacando el hecho de que la oscilación en la concentración de los distintos ácidos hidroxicinámicos ¿en particular el ácido p-coumárico (cuya concentración aumenta con la maduración)¿ fue el factor con la mayor influencia en la variabilidad de los datos. La influencia de los ácidos hidroxibenzóicos parece estar más relacionada con la variación entre los cultivos. El último capítulo de esta sección (Capítulo 3) está relacionado con el desarrollo de un método para CZE acoplado a MS utilizando dos aproximaciones diferentes (MRM y Full Scan) para evaluar, tanto cualitativa como cuantitativamente, los cambios en el perfil metabólico de frutos de aguacate, prestando particular atención a 10 metabolitos específicos que pertencen a diferentes familias químicas. Para este estudio se emplearon 18 muestras de aguacate que procedían de una misma variedad de aguacate, pero habían sido recogidas en distintos momentos de la campaña de recolección. Ambas aproximaciones de MS se compararon en base a sus parámetros analíticos y también en base a los resultados cuantitativos obtenidos con cada una de ellas, mostrando buena concordancia. La concentración de 8 de los 10 metabolitos analizados disminuyó con la maduración, mientras que los otros dos compuestos (ácido ferúlico y de nuevo el ácido p-coumárico) presentaron un comportamiento opuesto. La sección II está dedicada principalmente a la utilidad de LC y MS para el estudio del perfil metabólico de los frutos de aguacate. En ella es posible encontrar 3 capítulos. El primero es el Capítulo 4 y describe un método LC-DAD-ESI-TOF MS para llevar a cabo la caracterización de 3 variedades distintas de aguacate en cuanto a compuestos fenólicos se refiere, incluyendo tanto ácidos fenólicos como flavonoides. Haciendo uso del método desarrollado fuimos capaces de identificar 17 compuestos de forma inequívoca, mientras que otros 25 metabolitos se identificaron tentativamente teniendo en cuenta la exactitud y la información isotópica proporcionada por el espectrómetro de masas TOF. El Capítulo 5 hace referencia al desarrollo y optimización de un método para UHPLC-UV/ESI-TOF MS para realizar un análisis completo del perfil de metabolitos encontrado en los extractos metanólicos de 13 variedades de aguacate en dos estados de maduración distintos. La aplicación de esta técnica analítica permitió conocer por primera vez la identidad tentativa de unos 200 metabolitos de distintas familias químicas. Fue posible asegurar con certeza la identidad de 60 de los compuestos, 20 de los cuales se pudieron cuantificar en base a su estándar comercial. Finalmente, el Capítulo 6 engloba un estudio muy interesante sobre la evolución metabólica de muestras pertenecientes a 4 variedades de aguacate que han sido recogidas en distintos puntos del periodo de cosecha. La tercera y última de las secciones está compuesta por 4 capítulos en los que GC-MS ha sido utilizada para el estudio del metaboloma del aguacate. En primer lugar, el Capítulo 7 muestra la optimización de una metodología donde GC es usada como técnica de separación y se acopla a dos detectores (FID y APCI-TOF MS) que trabajan en paralelo. Este método se aplicó a la determinación cuantitativa de los cambios producidos en el perfil metabólico de Persea americana, cuantificando analitos provenientes de varias familias químicas (ácidos orgánicos, fitohormonas, vitaminas, flavonoides y ácidos fenólicos) en 13 variedades de aguacate en dos estados de maduración específicos. Dicho método fue también completamente validado y se compararon los parámetros analíticos de los dos detectores, manifestando ambos características analíticas más que aceptables. Una vez establecidos los parámetros analíticos del método, se logró la cuantificación de 27 compuestos mediante GC-APCI-MS, y sin embargo GC-FID sólo permitió la correcta cuantificación de 7 analitos. En general, la concentración de flavonoides y ácidos orgánicos tendió a disminuir con el proceso de maduración, observándose una tendencia opuesta para los derivados del ácido hidroxicinámico y la vitamina B5. Tras los análisis estadísticos, los ácidos quínico y p-coumárico, la epicatequina y la quercetina resultaron ser algunos de los metabolitos más influyentes en la clasificación de las muestras bajo estudio. El siguiente capítulo (Capítulo 8) resume los pasos seguidos en la creación de una base de datos para GC-FID/APCI-TOF MS. Se trata de una técnica poco habitual en estudios metabolómicos, hecho propiciado en gran medida a la ausencia de bibliotecas espectrales que faciliten la identificación de compuestos. La base de datos se construyó incluyendo aquellos metabolitos que pueden ser encontrados con facilidad en matrices alimentarias y en fluidos biológicos. Hasta la fecha, dicha biblioteca contiene información sobre índices de retención, así como espectros de MS y MS/MS, de aproximadamente 150 compuestos (está siendo actualizada). Este trabajo se desarrolló durante una estancia en el Centro de Proteómica y Metabolómica del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) en Leiden, Holanda. El Capítulo 9 describe la primera aplicación en la que GC-APCI-MS es empleada para llevar a cabo el estudio del perfil metabólico para el análisis de todos los metabolitos, susceptibles de ser analizados con el método propuesto, en muestras de aguacate. Este acoplamiento, poco habitual para GC, se comparó con otra más habitual en los laboratorios, como es GC-EI-Q MS, que hace uso de EI como fuente de ionización y Q como analizador de masas. La comparación se hizo en base a las señales de MS obtenidas con ambos sistemas de ionización. Utilizando dichas técnicas fue posible identificar 100 metabolitos en 3 variedades de aguacate. Este trabajo también permitió poner de manifiesto la utilidad y aplicabilidad de la nueva biblioteca espectral para la identificación de un importante número de compuestos. Para cerrar esta sección, en los Capítulos 10 y 11 se pretende destacar la utilidad de herramientas quimiométricas en estudios metabolómicos. Se emplearon distintos análisis multivariantes para tratar un conjunto de datos obtenido mediante GC-APCI-TOF MS y GC-EI-Q MS, las cuales permitieron obtener información de interés sobre la evolución metabólica de 13 variedades de aguacate que se encontraban en dos estados de maduración diferentes. Finalmente, hay un capítulo independiente (Capítulo 12) donde se discute la complementariedad existente entre las distintas tecnologías ómicas. Es bien conocido que las matrices vegetales o alimentarias están constituidas por una amplísima variedad de sustancias que provienen de familias químicas muy diversas y que están presentes en cantidades muy diferentes. Esta complejidad del metaboloma hace extremadamente difícil llegar a conocer completamente el perfil metabólico de una planta o un alimento, siendo necesario hacer uso de distintas aproximaciones analíticas que nos proporcionen información complementaria.