Evaluation of the modulatory role of bioactive compounds obtained from products and by-products of olive grove origin on the pathogenesis of Alzheimer's disease in the experimental model Caenorhabditis elegans

Resumen

Resumen La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa multifactorial de etiología desconocida, diagnosticada por primera vez por Alois Alzheimer en 1907. Se caracteriza por un deterioro progresivo de la función cognitiva, la memoria, así como disfunciones del lenguaje y la orientación. La etiopatogenia de la EA se caracteriza por dos eventos histopatológicos: la agregación de placas seniles formadas por péptidos ß-amiloide (Aß) en el sistema nervioso central y la formación de ovillos neurofibrilares (NFT) asociados a la acumulación de proteína tau en el hipocampo, área neocortical y amígdala. Aunque todavía no existe una terapia farmacológica para su tratamiento, las intervenciones nutricionales preventivas y/o terapéuticas frente a la EA han ido ganando protagonismo en los últimos años. Se sabe que el 35% de las demencias podrían ser causadas por factores de riesgo modificables asociados al estilo de vida, incluido el tipo de dieta. En particular, se ha demostrado que la Dieta Mediterránea (DM), caracterizada por un alto consumo de legumbres, verduras, frutas, vitaminas y aceite de oliva virgen, y un bajo consumo de carne roja, reduce la incidencia de la EA. La DM presenta un alto aporte de sustancias bioactivas como los compuestos fenólicos, que han demostrado ejercer un efecto protector en la EA. Las hojas del olivo (OL) son el subproducto más abundante en la industria del olivar. Los OL tienen excelentes propiedades medicinales gracias a la amplia variedad de compuestos bioactivos presentes en ellas. En particular, la ingesta de compuestos fitoquímicos presentes naturalmente, como oleuropeína, hidroxitirosol y luteolina, se relaciona con efectos neuroprotectores en la EA a través de la modulación de mecanismos como el estrés oxidativo y la neuroinflamación, además de reducir el depósito y la toxicidad de las proteínas mal plegadas involucradas. Partiendo de los aspectos mencionados anteriormente, la hipótesis de este estudio es que la enfermedad de Alzheimer, junto con mecanismos relacionados como la función colinérgica, el estrés oxidativo y los procesos inflamatorios, pueden ser modulados por subproductos obtenidos de la industria del olivar. Es crucial reconocer que el estado inflamatorio y redox dentro de las células juega un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. En vista de esto, el uso de extractos de hoja de olivo podría ser un enfoque interesante para desarrollar nutracéuticos como terapia adyuvante para la enfermedad de Alzheimer. El principal objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar el efecto de los extractos de hoja de olivo para contrarrestar los efectos deletéreos de la enfermedad de Alzheimer y sus características. Para alcanzar este objetivo general se establecieron los siguientes objetivos específicos: 1. Evaluar la capacidad antioxidante de cincuenta muestras de hojas de olivo procedentes de cinco países diferentes. 2. Caracterización fitoquímica de estos extractos. 3. Evaluación de la actividad inhibidora de la colinesterasa, la ciclooxigenasa-2 y la oxidación del hierro de estos extractos. 4. Evaluación toxicológica de los cincuenta extractos de hoja de olivo en el modelo experimental de C. elegans. 5. Selección de tres muestras (baja, media y alta actividad) a ensayar con base en lo antes mencionado. 6. Evaluación de los efectos de los tres extractos OL en marcadores relacionados con la biología redox y la red de proteostasis en diferentes cepas de C. elegans. 7. Explorar los efectos del tratamiento sobre los marcadores de EA en modelos tanto in vitro como de C. elegans, así como investigar la biología redox y profundizar en las vías de señalización molecular asociadas. Los resultados señalaron que el origen geográfico influyó considerablemente en el perfil fitoquímico, especialmente en relación con el contenido de secoiridoides, flavonoides, iridoides, hidroxicumarinas y ácidos hidroxicinámicos. La capacidad antioxidante se asoció con el contenido total de compuestos fenólicos y flavonoides, que destacaron en las muestras de España e Italia. También se demostró que la actividad inhibidora de la colinesterasa estaba influenciada por varios compuestos presentes en la OL, siendo las muestras española, italiana y portuguesa las más interesantes para este propósito. A pesar de la notable capacidad para inhibir la actividad de la COX-2 ejercida por los diferentes OL, no se observó ningún efecto relacionado con el origen de este marcador entre los países investigados. La evaluación a gran escala de los cincuenta extractos de hoja de olivo demostró la ausencia de toxicidad letal en el C. elegans, como lo demostraron las pruebas de letalidad, crecimiento y embriotoxicidad. No obstante, se detectaron efectos tóxicos menores en términos de menor crecimiento de los nematodos en extractos de hoja de olivo con elevado contenido en apigenina, eriodyctiol, esculina o decaffeoilverbascósido. De la misma manera, los extractos OL demostraron importantes actividades antiinflamatorias, anticolinérgicas y antioxidantes. Se identificaron compuestos como luteolina-7-O-glucósido, isoharmnentina y derivados de apigenina como contribuyentes importantes a la actividad inhibitoria de la AChE. Entre el resto de los compuestos, destacan los derivados de la oleuropeína y el hidroxitirosol. En cuanto a la actividad inhibidora de la COX-2, el enriquecimiento de OL en secoiridoides pareció ser un determinante significativo del efecto inhibidor observado. La oleuropeína y sus derivados, junto con el contenido de ligstrosido, pueden ejercer un papel importante en la actividad inhibidora de la COX-2. Entre el resto de los compuestos cabe destacar la luteolina 7-O-glucósido y el verbascósido. De la misma manera, la diosmetina parece estar asociada negativamente con el efecto inhibidor de la OL, probablemente atribuido a la conversión de luteolina en diosmetina. Finalmente, los autores demostraron que tanto los secoiridoides como los flavonoides contribuyen por igual al efecto antioxidante observado. Por ejemplo, la oleuropeína y sus derivados, el contenido de ligstrosido y luteolina-7-O-glucósido, pueden ejercer un papel importante en la capacidad antioxidante reductora del hierro. Entre el resto de los compuestos destaca el contenido en hidroxitirosol, hidroxicumarinas y verbascósidos. Posteriormente se seleccionaron tres muestras de hoja de olivo con diferentes perfiles biomédicos y fitoquímicos. Para ello se generaron tres categorías: categoría low, categoría mid y categoría high en base a las puntuaciones obtenidas en las pruebas para AChE IA, COX-2 IA, FRAP, TPC y TFC. Los tres extractos de hoja de olivo han demostrado una moderada capacidad inhibidora in vitro de la AChE, COX-2 y la actividad reductora de hierro, siendo el extracto high-OL el más eficaz. Según los experimentos que evaluaron los marcadores de EA, los extractos low y high OL mostraron resultados notables contra la proteotoxicidad de Aß y p-tau in vivo. Mid-OL ejerció una ligera mejora de la toxicidad amiloidogénica pero no afectó al comportamiento locomotor, lo que podría atribuirse al contenido de derivados de apigenina. Se ha demostrado que los factores de transcripción SKN-1/NRF-2 y sus dianas SOD-2 y SOD-3 están involucrados en los efectos de los extractos de low y high OL. Se ha demostrado que HSP-16.2 participó en los beneficios de los mid-OL. De hecho, los tres extractos de hoja de olivo pudieron modular la biología redox a través de la respuesta al estrés hormético, pero de una manera diferente. Todos los extractos fueron capaces de promover la nucleación de DAF-16/FOXO, mientras que solo los extractos de low y high OL bajo indujeron SKN-1/NRF-2. En presencia de patología amiloidogénica, todos tuvieron gran actividad previniendo un exceso de contenido de ROS intracelular, siendo el extracto de low OL el más activo. Los efectos protectores ejercidos por los efectos del extracto de OL bajo, medio y alto sobre el metabolismo del GSH pueden involucrar a GST-4, HSP-16.2 y SOD-2, respectivamente. A nivel mitocondrial, solo el extracto high OL fue capaz de reducir el contenido de ROS, mediante la participación de SOD-2. En la cepa tau hiperfosforilada, tanto el extracto de low OL como el high OL redujeron el contenido de ROS mitocondrial mediante la participación de DAF-16/SKN-1 y sus dianas SOD-2 y SOD-3. En conjunto, estos resultados abren la puerta al diseño y ensayo de nutracéuticos basados en extractos de hoja de olivo destinados a prevenir o mitigar diversos aspectos relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Summary Alzheimer's disease (AD) is a multifactorial neurodegenerative disease of unknown etiology, first diagnosed by Alois Alzheimer in 1907. It is characterized by a progressive deterioration of cognitive function, memory, as well as language and orientation dysfunctions. The etiopathogenesis of AD is characterized by two histopathological events: the senile plaque aggregation formed by amyloid-ß (Aß) peptides in the central nervous system and the formation of neurofibrillary tangles (NFTs) associated to the accumulation of tau protein in the hippocampus, neocortical area, and amygdala. Although there is still no pharmacological therapy for its treatment, the preventive and/or therapeutic nutritional interventions against AD have been gaining prominence in recent years. It is known that 35% of dementias could be caused by modifiable risk factors associated with lifestyle, including the type of diet. In particular, the Mediterranean Diet (MD), characterized by a high consumption of legumes, vegetables, fruits, vitamins, and virgin olive oil, and a low consumption of red meat, has been shown to reduce the incidence of AD. MD presents a high contribution of bioactive substances such as phenolic compounds, which have been shown to exert a protective effect in AD. The leaves of the olive (OL) tree (Olea europaea) are the most abundant by-product in the olive grove industry. OLs have excellent medicinal properties thanks to the wide variety of bioactive compounds present in them. In particular, the intake of phytochemical compounds naturally present in foods, such as oleuropein, hydroxytyrosol, and luteolin are related to neuroprotective effects in AD through the modulation of mechanisms such as oxidative stress and neuroinflammation, besides reducing the deposition and toxicity of the misfolded proteins involved. Building upon abovementioned aspects, the hypothesis of this study is that Alzheimer's Disease, along with related mechanisms such as cholinergic function, oxidative stress, and inflammatory processes, can be modulated by bioactive by-products obtained from the olive grove industry. It's crucial to acknowledge that the redox and inflammatory state within cells play a pivotal role in the development of Alzheimer¿s Disease. In light of this, the use of olive leaf extracts could be an interesting approach to develop nutraceuticals as adjuvant therapy for Alzheimer¿s Disease. The main objective of this doctoral thesis was to evaluate the effect of olive leaf extracts to counteract the deleterious effects of Alzheimer's disease and its hallmarks. To reach this general objective, the following specific objectives were established: 1. Assessment of antioxidant capacity of fifty olive leaf samples from five different countries. 2. Phytochemical characterization of these extracts. 3. Evaluation of the cholinesterase, cyclooxygenase-2, and iron-oxidative inhibitory activity of these extracts. 4. Toxicological evaluation of the fifty olive leaf extracts in the C. elegans experimental model. 5. Selection of three samples (low, medium, and high activity) to be tested based on the aforementioned. 6. Assessment of the three OL extracts effects in markers related to redox biology and proteostasis network in different C. elegans strains. 7. Exploring the treatment effects on AD markers in both in vitro and C. elegans models, as well as investigating redox biology and delving into the associated molecular signaling pathways. Results pointed out that the geographical origin considerably influenced the phytochemical profile, especially in relation to the content of secoiridoids, flavonoids, iridoids, hydroxycoumarins, and hydroxycinnamic acids. The antioxidant capacity was associated with the total content of phenolic compounds and flavonoids, which stood out in the samples from Spain and Italy. It was also shown that the inhibitory cholinesterase activity was influenced by several compounds present in the OL, with the Spanish, Italian, and Portuguese samples being the most interesting for this purpose. Despite the remarkable ability to inhibit COX-2 activity exerted by the different OLs, no origin-related effect was observed for this marker among the investigated countries. The large-scale assessment of the fifty olive leaf extracts demonstrated absence of lethal toxicity in the C. elegans Wild type, as demonstrated by lethality, growth and embryotoxicity test. Notwithstanding, minor toxic effects in terms of lower growth of the nematodes were detected in olive leaf extracts with elevated content in apigenin, eriodyctiol, esculin, or decaffeoylverbascoside. In the same way, OL extracts demonstrated significant anti-inflammatory, anti-cholinergic, and antioxidant activities. Compounds like luteolin-7-O-glucoside, isoharmnentin, and apigenin derivatives were identified as significant contributors to the AChE inhibitory activity. Among the rest of compounds, oleuropein derivatives, and hydroxytyrosol, showed noteworthy potential. Regarding COX-2 inhibitory activity, the enrichment of OL in secoiridoids seemed to be a significant determinant of the observed inhibitory effect. Oleuropein and its derivatives, along with ligstroside content, may exert an important role in the COX-2 inhibitory activity. Among the rest of compounds, luteolin 7-O-glucoside and verbascoside should be highlighted. In the same way, the diosmetin seems to be negatively associated with inhibitory effect of OL, probably attributed to the conversion of luteolin to diosmetin. Finally, authors demonstrated that both secoiridoids and flavonoids were found to contribute equally to the observed antioxidant effect. To cite, oleuropein and its derivatives, ligstroside and luteolin-7-O-glucoside content, may exert an important role in the ferric reducing antioxidant capacity. Among the rest of compounds, hydroxytyrosol, hydroxycoumarins, and verbascoside content must be highlighted. Then, three olive leaf samples with different biomedical and phytochemical profiles were selected. For this purpose, three categories were generated: the low category, the medium category, and the high category based on AChE IA, COX-2 IA, FRAP, TPC, and TFC. The three olive leaf extracts demonstrated a moderate in vitro inhibitory capacity of the AChE, COX-2, and iron-reducing activity, being the high-OL extract the most effective. According to AD experiments, the low and high-OL extract showed remarkable results against Aß and tau proteotoxicity in vivo. Mid-OL exerts a slight improvement of amyloidogenic toxicity but did not affect to the locomotive behavior, which could be attributed to the apigenin derivatives content. The transcription factors SKN-1/NRF-2 and its downstream SOD-2 and SOD-3 has been demonstrated to be involved in the effects of low and high-OL extracts. HSP-16.2 has been shown to participate in mid-OL extracts benefits. In fact, the three olive leaf extracts were able to modulate redox biology through hormetic stress response but in a different way. All the extract were able to promote the nucleation of DAF-16/FOXO, whereas only low and high OL extract induced SKN-1/NRF-2. In presence of amyloidogenic pathology, all of them had great activity preventing an excess of intracellular ROS content, being the low-OL extract the most active. The protective effects exerted by low, mid, and high-OL extract effects on GSH metabolism may involve GST-4, HSP-16.2, and SOD-2, respectively. At mitochondrial level, only high-OL extract was able to reduce ROS content, through the involvement of SOD-2. In the hyperphosphorylated tau strain, both low and high OL extract reduced mitochondrial ROS content through the involvement of DAF-16/SKN-1 and its direct downstream SOD-2 and SOD-3. Overall, these results open the door for the design and testing of nutraceuticals based on olive leaf extracts aimed at preventing or mitigating various aspects related to Alzheimer's disease.