Epidemiological Studies on Zoonotic Leishmaniasis and New Trials for Studying the Effect of Melatonin on the Parasite

Resumen

Summary in English Introduction Leishmaniasis remains an important public health problem caused by protozoan of genus Leishmania and transmitted by the bite of a female phlebotomine sand fly. Humans, rodents, and some animal species are considered reservoir for the disease. Among other animal species, the dogs are the most important reservoirs in a domestic environment, maintaining the endemic focus of the parasite. The disease has been also linked to tropical and subtropical regions besides being an endemic disease in the Mediterranean basin and South America. The incidence of the disease increases in immunocompromised individuals like HIV and transplanted patients. In Spain, besides the traditional epidemiological pattern involved in the zoonotic infection, new alternative models of transmission are emerging by habit changes. Depending on the infecting parasite species and host immune response, three forms of the disease are known: cutaneous, mucocutaneous, and disseminated visceral leishmaniasis of fatal prognosis. In fact, the recent years have witnessed extraordinary potential progress and ever growing in organ transplantation worldwide as a consequence of sustained economic growth and the higher investments in tertiary healthcare policies in many developing countries. Spain is widely known as one of the countries with the highest transplant rates. As result of lack of routine serology for blood or organ donors in areas of high endemicity, transplanted recipients are susceptible to a broad spectrum infectious agents resulting in different symptoms. Leishmania is considered one of opportunistic infections but it is not common disease among transplanted patients, however, the growing pool of transplant survivors and high migration dynamics steadily increases the numbers of infected cases among transplant recipients especially among renal transplanted recipients mainly in southern Europe, particularly with VL. Despite several leishmanial researches, many questions are still unanswered. Early case detection followed by adequate treatment represents the key to the control of the disease that may improve the prognosis and can reduce transmission. Diagnosis of Leishmania infection is still somewhat controversial due to absence of gold standard technique that appears mandatory to establish effective strategic programmes. Current tools of diagnosis are several and they rely mainly on parasite detection by microscopic examination or by molecular biology-based assays for detecting parasite DNA (PCR) but none of these methods have become popular in field diagnosis. The conventional parasitological techniques are also risky, time consuming, invasive for the patient and require skilled personnel. The molecular methods also require the availability of software, probes and primers, which cannot easily applied especially in field settings and still not affordable for many clinical and scientific laboratories in developing countries. Interestingly, serological diagnosis using several tests is an alternative tool for the parasitological diagnosis; can be used for a large-scale and decentralized diagnosis, however, all the serological techniques share many drawbacks like that related to sensitivity or specificity have been reported. On the other hand, the presence of different Leishmania species and various manifestations also complicates the therapeutic approach, especially in immunocompromised patients. A limited number of effective antileishmanial agents are available for chemotherapy, and many of them are expensive with severe side effects or have a markedly reduced effectiveness due to the development of drug resistance. Based upon several published works, plants have different biologically active compounds in their organs, which can be pharmacologically studied. Melatonin is an indoleamine synthesized and released by several organs. Several studies have included the relationship between melatonin and many parasitic or viral diseases. Given above information, there is a genuine need to develop a novel effective and less toxic antileishmanial drug for amelioration of patient¿s life quality besides the necessity for surveying strategy using a rapid and reliable diagnostic test in one of animal reservoirs in certain endemic area (cats). Methods: The first phase of the present work included a serological study about Leishmania infection among transplanted organ recipients from southern Spain followed by assessment of the occurrence of Leishmania infantum in domestic cats from an endemic region in North-western Italy, named Liguria, by the association of both serological and molecular tests. In the second phase of our work, we have studied the effect of melatonin against the parasite in vitro. Results: Our results evidence that a relatively high prevalence of L.infantum was recorded among kidney transplanted recipients, where 30 (4.08%) samples were positive for L. infantum out of 625 examined serum samples. Regarding the cross sectional survey in cats, we have found that out of 250 examined serum samples from cats, 33 samples (13.12%) were positive for L. infantum, whereas of the 282 blood samples, 80 (28.37%) were positive. In accordance with therapeutic trials, melatonin not only demonstrated a significant antileishmanial activity in vitro but was also accompanied by an alteration of the several mitochondrial parameters, including calcium homeostasis and by changes in some mitochondrial parameters critical to parasite survival. Conclusions: These multiple results suggest that 1) the routine serological testing for VL should be initially considered before undergoing transplantation for both donor and recipient transplant patients living or traveling in endemic areas to prevent such serious post-transplantation infection, 2) High prevalence of L.infantum among cats in the studied area which show the importance of cats not only as reservoir for the disease, but also the need for further future research for accurate diagnosis of this zoonosis, 3) Western blot and PCR would be a novel potential tools in diagnosis of Leishmania infection in cat, and 4) melatonin may be a potent antileishmanial agent, and therefore further research is warranted to elucidate the effects of melatonin in association with other antileishmanial drugs combined with examination the role of melatonin receptors in these effects and their underlying mechanisms. These observations together could be of special attention for the people to identify the risk factors of transmission of such protozoan and would be helpful in earlier detection, treatment and as a consequence in eradication of this neglected disease. Summary in Spanish (Resumen) Introducción: La leishmaniasis es a día de hoy un conjunto de enfermedades de interés internacional causadas por protozoos del género Leishmania y transmitido por la picadura de un flebotomo femenino. Los seres humanos, roedores, y algunas especies animales se consideran reservorio de dicha enfermedad. Entre otras especies animales, los perros son los reservorios más importantes en el entorno doméstico, manteniendo el foco endémico del parásito. La enfermedad se ha vinculado también a regiones tropicales y subtropicales, además de ser una enfermedad endémica en la cuenca del Mediterráneo y América del Sur. La incidencia de esta enfermedad es aún más amplia en pacientes inmunodeprimidos, tales como pacientes con VIH y pacientes trasplantados. En España, además del patrón epidemiológico tradicional causante de la zoonosis, están surgiendo nuevos modelos alternativos de transmisión a raíz de los cambios de hábitos. Dependiendo de la especie causante de la enfermedad, así como de la respuesta inmunitaria del huésped, se conocen tres formas de la enfermedad: cutánea, mucocutánea, y visceral, ésta última diseminada y en ausencia de tratamiento suele resultar fatal. Los últimos años han sido testigos de avances de extraordinario potencial y de crecientes casos de transplantes de órganos en todo el mundo como consecuencia de un crecimiento económico continuado y una mayor inversión en políticas de salud terciarias en muchos países en desarrollo. España es ampliamente conocida como uno de los países con las tasas más altas de trasplante. Como resultado de la falta de serología rutinaria de sangre o de órganos donantes en áreas de alta endemicidad, los receptores trasplantados son susceptibles a un amplio espectro de agentes infecciosos que resultan en síntomas diferentes. La Leishmania es considerada un agente infeccioso oportunista, pero no es una enfermedad común entre los pacientes trasplantados. Sin embargo, el creciente número de supervivientes de trasplante y la alta tasa de migración aumenta constantemente el número de casos de infección entre los receptores de trasplante, especialmente entre los receptores de transplantes renales y en el sur de Europa, y en particular a la LV. A pesar de las varias investigaciones en Leishmania, muchas preguntas siguen sin respuesta. La detección temprana de los casos, seguida de un tratamiento adecuado, representan la clave para el control de la enfermedad con lo que se podría mejorar el pronóstico y reducir la transmisión. En los últimos años se ha producido un extraordinario avance en el diagnóstico de la infección por Leishmania, pero el principal reto sigue siendo la falta de técnica de referencia, que parece obligatoria para establecer programas estratégicos eficaces para controlar y erradicar la enfermedad. Las herramientas actuales de diagnóstico son variadas y se basan principalmente en la detección de parásitos mediante examen microscópico o mediante ensayos basados en la biología molecular para la detección de ADN del parásito (PCR), pero ninguno de estos métodos se han hecho populares en el diagnóstico de campo. Las técnicas parasitológicas convencionales también son arriesgadas, lentas, invasivas para el paciente y requieren personal cualificado. Los métodos moleculares también requieren de la disponibilidad de software, sondas y cebadores, que no son fácilmente aplicables, sobre todo en el campo, y todavía no son asequibles para muchos laboratorios clínicos y científicos en los países en desarrollo. El diagnóstico serológico es una herramienta alternativa para el diagnóstico parasitológico; puede ser utilizado para una gran escala y el diagnóstico descentralizado, sin embargo, casi todas las técnicas serológicas comparten muchos inconvenientes como los relacionados con la sensibilidad o especificidad entre diferentes ubicaciones. De hecho, la presencia de diferentes especies de Leishmania y diversas manifestaciones también complican el enfoque terapéutico, especialmente en pacientes inmunodeprimidos, ya que los rendimientos de quimioterapia convencionales ofrecen pobres resultados e inconsistentes. Solo un número limitado de agentes eficaces anti-Leishmania están disponibles para la quimioterapia, y muchos de ellos son caros y o bien tienen efectos secundarios graves, o presentan una eficacia marcadamente reducida debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos. Sobre la base de varios trabajos publicados, las plantas tienen diferentes compuestos biológicamente activos en sus órganos, que pueden ser estudiados farmacológicamente. La melatonina es un indolamina sintetizada y liberada principalmente por la glándula pineal durante la oscuridad. Varios estudios han incluido la relación entre la melatonina y muchas enfermedades parasitarias o virales. Basándonos en esta información, existe una auténtica necesidad de desarrollar un nuevo fármaco anti-Leishmania, eficaz y menos tóxico, para la mejora de la calidad de vida del paciente junto a la necesidad de conseguir una prueba de diagnóstico rápida y fiable para el diagnóstico de la infección por Leishmania, ya sea en humanos o en los principales animales reservorios (perros y gatos). Metodología: La primera fase de este trabajo incluyó un estudio serológico sobre la infección causada por Leishmania entre los receptores de órganos trasplantados del sur de España, siguió por un estudio epidemiológico sobre la presencia de Leishmania infantum en los gatos (domésticos) de una región endémica en el norte-oeste de Italia (Liguria), por la asociación de ambas pruebas serológicas (western blotting) y moleculares (PCR). En la segunda fase de nuestro trabajo, hemos estudiado el efecto de la melatonina contra el parásito in vitro. Resultados: Nuestros resultados evidencian que una prevalencia relativamente alta de L. infantum se registró entre los receptores de trasplante de riñón, donde 30 (4.08%) muestras fueron positivas para L. infantum de 626 muestras de suero examinadas. Por otra parte con respecto a los ensayos terapéuticos, la melatonina no sólo demostró una actividad significativa contra Leishmania in vitro o in vivo, sino también fue acompañada por una alteración de varios parámetros mitocondriales, incluyendo la homeostasis del calcio y por cambios en algunos parámetros mitocondriales críticos para la supervivencia del parásito. En cuanto a la encuesta epdimiological en los gatos, también hemos encontrado que 33 muestras (13,12%) fueron positivos de 250 muestras de suero examinadas para L. infantum con el western blotting, mientras que de las 282 muestras de sangre, 80 (28,37%) fueron positivas. Esto indica que WB y PCR sería un método rápido, sensible, específico y preciso para el diagnóstico de la infección por Leishmania en muestras de gatos. Conclusiones: Estos múltiples resultados sugieren que 1) las pruebas serológicas de rutina para LV deben ser tenidas en cuenta inicialmente a la hora de realizarse un trasplante, habiendo de llevarse a cabo en el donante y en el receptor si éstos viven o viajan a áreas endémicas para evitar la grave infección post-trasplante, que puede llegar a ser mortal en tales pacientes, 2 ) la melatonina puede ser un agente anti-leishmaniapotente, y por lo tanto es necesaria más investigación para dilucidar los efectos de la melatonina en asociación con otros fármacos contra leishmania, combinados con el examen del papel de los receptores de melatonina en estos efectos y sus mecanismos subyacentes, 3) alta prevalencia de L. infantum entre los gatos en el área del estudio que muestran la importancia de los gatos no sólo como reservorio de la enfermedad, sino también la necesidad de una mayor investigación en el futuro para el diagnosis esta zoonosis, y 4) Western blot y PCR podrían ser unas potencial herramientas en el diagnóstico de la infección por Leishmania en muestras en los gatos. En conclusion, estas observaciones en conjunto podrían ser de especial interés para identificar los factores de riesgo de transmisión a las personas de dichos protozoos y serían útiles para la detección temprana, el tratamiento y, como consecuencia, para la erradicación de esta enfermedad olvidada. References: Alvar, J., Velez, I.D., Bern, C., Herrero, M., Desjeux, P., Cano, J., Jannin, J., den Boer, M., Team, W.H.O.L.C., 2012, Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS one 7, e35671. Chappuis, F., Sundar, S., Hailu, A., Ghalib, H., Rijal, S., Peeling, R.W., Alvar, J., Boelaert, M., 2007, Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control? Nat Rev Microbiol 5, 873-882. Elmahallawy, E.K., Sampedro Martinez, A., Rodriguez-Granger, J., Hoyos-Mallecot, Y., Agil, A., Navarro Mari, J.M., Gutierrez Fernandez, J., 2014, Diagnosis of leishmaniasis. J Infect Dev Ctries 8, 961-972. 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