Caracterización de compuestos fenólicos de subproductos de origen vegetal mediante cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas y evaluación de la actividad biológica

Resumen

En esta memoria se reúnen los resultados obtenidos durante la realización de la Tesis doctoral titulada “Caracterización de compuestos fenólicos de subproductos de origen vegetal mediante cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas y evaluación de la actividad biológica”, donde se valora el potencial de los subproductos de aguacate (piel, hueso y corteza del hueso) como fuente de compuestos fenólicos con potencial uso para el desarrollo de nutracéuticos o como nuevos ingredientes para la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica, así como la bioactividad que éstos presentan. La memoria se ha dividido en dos secciones principales: Introducción y Parte experimental. En la Introducción se describen, en primer lugar, una visión general de la matriz objeto de estudio, desde su origen, producción mundial, bioactividad hasta su industrialización. En este último punto se profundizó detallando el proceso de elaboración del guacamole como producto estrella derivado del aguacate, su producción en España, la generación de residuos (piel, hueso y corteza del hueso) y el potencial bioactivo de los mismos. A continuación, se describen las diferentes etapas del procedimiento analítico para la determinación de compuestos fenólicos presentes en los subproductos de aguacate. Como primera etapa se describe el pre-tratamiento de muestra, en este sentido, debido a que las matrices evaluadas en esta tesis doctoral poseen una elevada actividad de agua, se hace referencia al secado de las muestras, incluyendo una breve descripción de los diferentes métodos existentes y su viabilidad a nivel industrial. Posteriormente, se detallan los métodos de extracción más comunes para compuestos bioactivos de matrices vegetales, entre ellos métodos convencionales y mediante técnicas avanzadas “Green” enmarcadas dentro de la conocida como Química Verde. En las siguientes secciones nos adentramos en la separación y detección de compuestos fenólicos, prestando especial atención a las técnicas analíticas usadas en la parte experimental, fundamentalmente como técnica separativa la cromatografía líquida de alta resolución y como sistemas de detección la espectroscopía de absorción UV-Vis y la espectrometría de masas con analizadores de tiempo de vuelo y cuadrupolo-tiempo de vuelo. Por último, se hace un recorrido por la bioactividad de los compuestos fenólicos presentes en los subproductos de las industrias transformadoras de aguacate, prestando especial atención a su papel como antioxidantes y como inhibidores de enfermedades neurodegenerativas. En la segunda parte se incluye la "Parte experimental, resultados y discusión" alcanzados en la presente Tesis doctoral. Es importante mencionar que los capítulos no se presentan en orden cronológico y están numerados consecutivamente, independientemente de la sección a la que pertenezcan. El primero y el segundo capítulo tratan de la optimización del proceso de secado y la extracción mediante líquidos presurizados (PLE) de compuestos bioactivos de piel y hueso de aguacate, respectivamente. Los otros dos capítulos restantes describen la caracterización exhaustiva de los extractos obtenidos de piel y hueso de aguacate en la etapa anterior mediante HPLC-MS. En el Capítulo 1, se evaluó el efecto de la temperatura de secado sobre el contenido total de compuestos fenólicos (TPC) y la concentración individual de los compuestos identificados en la piel de aguacate. En este sentido, se obtuvieron las cinéticas de secado para diferentes temperaturas ensayadas (45-85 °C). Además, se validó un método analítico para cuantificar compuestos fenólicos en piel de aguacate por HPLC-DAD-ESI-TOF-MS evaluando los parámetros de linealidad, sensibilidad y precisión. Además, se utilizó la metodología de superficie de respuesta (RSM) para optimizar la extracción de compuestos fenólicos mediante el uso combinado de PLE y disolventes GRAS y comprobar así que la PLE representa una poderosa herramienta para obtener extractos de piel de aguacate de alta concentración en compuestos bioactivos con potencial uso en el sector alimentario, cosmético o farmacéutico. En este sentido, se eligió como variables independientes la composición de disolvente de extracción usando mezclas hidroalcohólicas de EtOH:H2O (0-100%, v/v) y la temperatura (40-200 °C), y como variable respuesta el TPC de los extractos obtenidos. Además, se hizo una comparativa del rendimiento de extracción obtenido mediante PLE con los datos obtenidos a partir del uso de métodos de extracción tradicionales (sólido-líquido) como la maceración dinámica. El siguiente capítulo (Capítulo 2) describe la optimización de PLE de los compuestos fenólicos del hueso y corteza del hueso de aguacate. En este estudio, el hueso se secó a cinco temperaturas diferentes. A continuación, para cada muestra de hueso deshidratado, se usó una metodología de RSM basada en un modelo de diseño compuesto central 22 para optimizar las condiciones de PLE usando como disolventes agua y etanol. Se utilizó como variables independientes la temperatura de extracción en el rango de funcionamiento del equipo y la composición del disolvente de extracción (0 – 100 % EtOH), mientras que TPC fue la variable respuesta. Además, los cambios de los perfiles fenólicos de las muestras durante los procesos de secado fueron evaluados por HPLC-DAD-ESI-TOF-MS con una metodología optimizada. A pesar de su gran potencial, el conocimiento sobre el perfil fenólico de los subproductos de aguacate es escaso, especialmente la piel, y es por esto que en el Capítulo 3 se realiza una caracterización pormenorizada y exhaustiva de los compuestos bioactivos presentes en el extracto de piel de aguacate obtenido mediante las condiciones óptimas de extracción y secado estudiadas en el Capítulo 1. La identificación se realizó mediante una potente plataforma analítica que aúna la excelente separación conseguida mediante HPLC con la sensible detección y capacidad de elucidación estructural del analizados QTOF-MS. Respecto al hueso de aguacate, a pesar de que algunos estudios sugieren su potencial uso como anticancerígeno, antiinflamatorio, antidiabético, antihipertensivo, hipocolesterolémico, antimicrobiano e insecticida, esta matriz no se ha caracterizado en profundidad en cuanto a su perfil fenólico se refiere. Por lo tanto, en el Capítulo 4 se realiza un estudio pormenorizado de la composición fenólica del hueso de aguacate mediante el uso combinado de PLE y HPLC-ESI-QTOF-MS. Para ello, el extracto estudiado fue el obtenido usando las condiciones de secado y extracción optimizadas en el Capítulo 2. Además, se evaluó el potencial bioactivo de la semilla de aguacate como antioxidante para su uso como ingrediente en las industria comética, farmacéutica y alimentaria usando metodologías basadas tanto en transferencia de electrones (métodos DPPH y TEAC) así como en la transferencia de átomos de hidrógeno (método ORAC).