Obtención de lactoferrina bovina mediante ultrafiltración de lactosuero

Resumen

El lactosuero es un subproducto de la industria quesera que contiene una serie de proteínas (a-lactoalbúmina, b-lactoglobulina, seroalbúmina bovina, lactoferrina e inmunoglobulinas) en concentraciones relativamente bajas pero con un alto valor biológico. Estas proteínas son muy usadas en la industria alimentaria por sus propiedades nutricionales y su solubilidad. Además, cada proteína, individualmente, tiene características biológicas, nutricionales y funcionales que las hacen muy interesantes para la mejora de fórmulas infantiles, alimentos funcionales y nutracéuticos. La lactoferrina, en particular, tiene propiedades antibacterianas, antivíricas, antiinflamatorias, estimula el sistema inmunológico y tiene facilidad para enlazar hierro. En animales de experimentación se ha observado que la lactoferrina suprime el crecimiento tumoral y metástasis e, incluso, puede inhibir la angiogénesis. Desafortunadamente, las técnicas existentes para la purificación o el fraccionamiento de proteínas a escala de laboratorio no han podido ser implantadas a escala industrial o suponen un coste elevado, únicamente viables para productos farmacéuticos. En este sentido, estudios recientes en procesos de filtración con membranas han proporcionado resultados alentadores. La filtración tangencial de alta resolución (HPTFF) ha sido sugerida como técnica viable para el fraccionamiento de proteínas a gran escala. Esta técnica se basa en las interacciones electrostáticas proteína-proteína y proteína-membrana, permitiendo la separación de moléculas de similar tamaño mediante el control de las condiciones de operación, fundamentalmente pH y fuerza iónica. Así, el objetivo de la investigación de esta Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de un proceso para la obtención de lactoferrina bovina a partir de lactosuero mediante la técnica de filtración tangencial de alta resolución. Para ello se ha diseñado, en primer lugar, la estrategia de fraccionamiento del suero para la recuperación de lactoferrina. Seguidamente, se ha llevado a cabo el estudio teórico de la recuperación de lactoferrina bovina por ultrafiltración empleando dicha estrategia. Por último, se ha realizado el estudio experimental del fraccionamiento de lactosuero para comprobar la viabilidad del proceso propuesto. En la estrategia seleccionada de fraccionamiento de lactosuero para recuperar lactoferrina mediante HPTFF se emplean dos etapas de ultrafiltración en cascada. En la primera etapa se deben retener inmunoglobulinas y lactoferrina, pasando a filtrado, preferentemente, a-lactoalbúmina, b-lactoglobulina y BSA. En la segunda etapa, el retenido de la etapa anterior se hace pasar por otra membrana, seleccionada de forma que la lactoferrina se recoja en el filtrado, quedando retenidas las inmunoglobulinas. Esta estrategia de fraccionamiento fue sugerida por el Prof. Andrew Zydney en 1998. En el estudio teórico se ha realizado la simulación de la recuperación de lactoferrina bovina a partir de lactosuero mediante la estrategia indicada anteriormente. Para ello, en primer lugar ha sido necesario el cálculo de la carga neta, peso molecular, radio de Stokes y radio efectivo de cada una de las proteínas, así como el cálculo de la fuerza iónica mínima en cada una de las etapas. El modelo del proceso está formado por ecuaciones diferenciales y algebraicas resultantes del planteamiento de balances de materia y ecuaciones de transporte de soluto a través de los poros de la membrana, asumiendo como premisas: modo de diafiltración continua, transmisión de proteína constante durante la filtración, no interacción entre las moléculas de proteínas y transmisión observada de cada proteína igual a la asintótica. Con todo ello, empleando la herramienta Solver de MS Excel, se ha resuelto el problema de optimización consistente en la determinación del pH, fuerza iónica y radio de poro para cada etapa, con el fin de minimizar el número de diavolúmenes totales del proceso, cumpliendo las siguientes restricciones: * Primera etapa: concentración final en retenido superior al 90 % de la inicial para IgG y LF; e inferior al 10 % para ALA, BLG y BSA. * Segunda etapa: concentración final en retenido igual a la inicial para ALA, BLG y BSA; superior al 90 % para IgG; e inferior al 10 % para LF. La simulación de esta estrategia ha puesto de manifiesto la posibilidad de fraccionamiento mediante dos etapas de diafiltración continua con las condiciones de operación siguientes: * Etapa 1: pH = 5.04, rP = 31.0 nm, I = 0.0082 M, N = 2.59%&/* Etapa 2: pH = 8.35, rP = 12.7 nm, I = 0.0030 M, N = 4.28 En el estudio experimental del fraccionamiento de lactosuero para comprobar la viabilidad del proceso propuesto, se obtuvieron los siguientes resultados: * El proceso de clarificación de lactosuero consistente en aumentar el calcio iónico y el pH, acompañado por calentamiento, para provocar la agregación de los complejos lipídicos y partículas de fosfato cálcico, da lugar a la mejora de la permeabilidad de la membrana, en términos de flujo de filtrado y transmisión de proteína, sin afectar a su composición proteica. * La membrana comercial más adecuada para llevar a cabo el fraccionamiento de lactosuero es la membrana de 300 kDa. * Las interacciones proteína-proteína son determinantes en cada una de las etapas, dando lugar a radios efectivos distintos de los teóricos y, consecuentemente, a transmisiones diferentes a las esperadas. Así, al pH óptimo de la primera etapa (pH 5) se han obtenido rendimientos en filtrado acumulado de tan sólo 8 y 2% para a-lactoalbúmina y b-lactoglobulina, respectivamente, y nulo para BSA. * La cuantificación individualizada de las posibles interacciones electrostáticas existentes resulta muy complicada dada la complejidad del lactosuero como mezcla real de proteínas y otros diversos componentes. Por tanto, ha sido necesario estudiar experimentalmente el efecto del pH sobre el fraccionamiento de lactosuero para poder determinar el óptimo para la primera etapa. Como consecuencia de este estudio, los valores de pH adecuados para la primera etapa han sido 3, 7 y 9. Se han propuesto tres estrategias de fraccionamiento: * Estrategia I: filtración a pH 9 seguida de centrifugación a pH 4.9. Como resultado de esta estrategia se ha obtenido una fracción enriquecida en lactoferrina con un rendimiento de 45.2%, con un factor de mejora de la pureza de 366%. * Estrategia II: filtración a pH 7 seguida de filtración a pH 4.9. Como resultado de esta estrategia se ha obtenido una fracción enriquecida en lactoferrina con un rendimiento de 6.2%, con un factor de mejora de la pureza de 225%. En esta estrategia cabe destacar que se consigue recuperar en los filtrados acumulados el 94 y 86% de la a-lactoalbúmina y b-lactoglobulina iniciales, respectivamente. * Estrategia III: filtración a pH 3 seguida de filtración a pH 4.9. Como resultado de esta estrategia se ha obtenido una fracción enriquecida en lactoferrina con un rendimiento de 85.4%, con un factor de mejora de la pureza de 392%. Las estrategias de fraccionamiento propuestas han dado lugar a filtrados y retenidos interesantes desde el punto de vista de la concentración y la purificación de determinadas proteínas. Estas fracciones obtenidas en cada estrategia, con purezas en proteína individual superiores a las del lactosuero original, pueden ser empleadas para la formulación de alimentos funcionales, o en el caso de requerimiento de mayor grado de pureza, como partida de procesos de separación por cromatografía, suponiendo una reducción de los costes de esta técnica.